瘤胃真菌体外产纤维素酶条件的筛选

厉学武，王利华，孙艳朋

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

纤维素类物质是自然界中存在的最廉价、最丰富的一类可再生资源。然而纤维素分子形成紧凑的、富含氢键的、嵌入在植物细胞壁的微纤维，所以纤维素很难被利用［1］。纤维素酶可以将纤维素降解为单糖，因此提高纤维素酶产量和活力是解决纤维素利用的重要前提。

自从Orpin 1975年发现厌氧真菌以来，国内外学者研究表明，厌氧真菌可分泌高活性纤维素酶、木聚糖酶和酯酶等多种酶，并在植物纤维降解中起着重要作用［2］。目前从瘤胃中分离得到的真菌共计6个属10余个种之多，所有已分离出的瘤胃真菌都具有溶解纤维的特性，并且都具有降解植物细胞壁中结构性碳水化合物的能力［3］。研究还发现，瘤胃真菌首先分离木质化的纤维组织，从而为细菌利用与木质素结合的纤维物质创造条件。虽然细菌是瘤胃内主要分解纤维的微生物，但瘤胃真菌壁降解的贡献可能远远超过细菌。通过对发酵后植物片段残余物的比较表明，瘤胃真菌对厚壁组织的降解显著高于瘤胃细菌［4］。

瘤胃真菌产生的木聚糖酶比瘤胃主要的纤维分解细菌产生的酶活力高5倍，比原虫和目前工业上常用的产纤维素木酶菌Thichoderma reesei菌株C-30等工业用产酶的微生物分泌的酶活力均高［5］。本试验采用L9（34）正交试验，通过测定木聚糖酶和羧甲基纤维素酶活以筛选崂山奶山羊瘤胃真菌产酶的最优发酵条件，提高瘤胃真菌产酶活性，为纤维素酶的研发提供应用基础。

1 材料与方法

1.1 菌株 瘤胃液取自装有永久性瘤胃瘘管的成年崂山奶山羊。采食后2h，经瘤胃瘘管从瘤胃抽取瘤胃液，放入充满二氧化碳的大离心管中，10mL的瘤胃液加入液体培养基（含有1000IU／mL的青霉素；1600μg／mL的链霉素，以抑制细菌生长），稀释10倍进行培养，制成真菌混合悬浮液用于接种。

1.2 试验设计 试验分别采用L9（34）正交表，氮源分别为（NH4）2SO4、NH4Cl和尿素；接种量分别为5mL、10mL和15mL（液体培养基的量分别为95mL、90mL和85mL）；培养基起始pH值分别为7.0、6.0和5.0；发酵温度分别为35℃、37℃和39℃，共9个试验组，每个试验组设3个 重复。每组玉米秸秆的用量为80mg／mL。

1.3 试验方法 液体培养基参照朱崇淼［6］的配制。NaHCO35.0g、葡萄糖1.0g、酵母膏1.0g、蛋白胨1.0g、缓冲液A 165mL缓冲液B 165mL、无细胞瘤胃液170mL、蒸馏水500mL。每1L缓冲液A中含KH2PO43g、NaCl 6g、（NH4）2SO43.9g、CaCl2·2H2O 0.4g、MgSO4·7H2O 0.6g，以蒸馏水作溶剂。每1L缓冲液B中含K2HPO4O3H2O 4 g，以蒸馏水作溶剂。培养基中加入1mL 0.1%刃天青作为厌氧指示剂。上述培养基配制好后通入CO2至饱和（溶液颜色由暗红色变为透明的黄色）后分装，分装前半小时加入0.15%L-半胱胺酸盐酸盐。无细胞瘤胃液的制备：取新鲜瘤胃液，用双层纱布过滤后，在4000r／min离心30min，取离心上清液。

试验用液体培养基则不含有葡萄糖，而是按0.1%添加CMC-Na。

1.4 测试项目与方法 在发酵结束，从各培养瓶中抽取适量发酵液上清液，测木聚糖酶活力及纤维素酶活力。将各培养瓶中发酵液经坩埚（坩埚己称重）真空过滤，底物残留及附着的菌体在坩埚中于105℃烘至恒重，计算底物的干物质消失率。木聚糖酶活力和羧甲基纤维素酶活力的测定均参照文献［7］。每分钟每mL酶液释放1μmol／L木糖（葡萄糖）的酶量为1个酶活单位（U）。参照张龙翔等［8］主编的生物实验方法和技术中的Bradford方法测定比活力。每分钟每毫克蛋白释放1μmol／L木糖（葡萄糖）的酶量定义为1个酶比活力单位（μ／mg·Protein）。

1.5 统计方法 采用Excel 2007对数据进行整理，并对正交试验结果的K和R值进行测定，干物质消化率采用Spss Statistics 18软件进行多重比较，数据采用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶 从表1的R值分析可知，影响试验结果的因素依次为D＞C＞B＞A，即对木聚糖酶活力的影响因素依次是发酵温度、培养基起始pH值、接种量及N源。从K值可以看出，A1B1C1D1组合木聚糖酶活力最高为8.34U／mL，即 （NH4）2SO4作为N源，接种量为5mL，发酵起始pH值＝5，发酵温度35℃的发酵组合最佳；A2B2C3D1组合木聚糖酶比活力最高为26.39U／mg。

表1 木聚糖酶活测定结果

2.2 羧甲基纤维素酶 从表2的R值分析可知，影响试验结果的因素依次为A＞B＞D＞C，即对羧甲基纤维素酶活力的影响因素依次是N源，接种量、发酵温度及培养基起始pH值。从K值可以看出，A1B3C3D3组合羧甲基纤维素酶活力最高为0.225U／mL，即 N源为 （NH4）2SO4，接种量为15 mL，培养基起始pH值为7，发酵温度39℃的组合酶活力最高，A3B2C1D3组合羧甲基纤维素酶比活力最高为0.253U／mg。

2.3 不同发酵底物DM降解率 以玉米秸秆为发酵底物，培养96h后其干物质降解率见图1。干物质降解率为34.6%～43.5%，处理4、5组和6组（NH4Cl组）的真菌发酵干物质消失率显著低于其他各处理组［（NH4）2SO4和尿素组］（P＜0.05）。

表2 羧甲基纤维素酶活力测定结果

图1 各处理组玉米秸的干物质降解率

3 讨论

厌氧真菌瘤胃真菌可产生纤维素分解酶、半纤维素分解酶（主要是木聚糖降解酶）、果胶酶、酯酶等13种酶。Lee等［9］曾报道，瘤胃厌氧真菌产生的木聚糖酶的酶活力比目前工业用木聚糖酶制剂生产菌米曲霉（Aspergillus oryzae）所产木聚糖酶的酶活力高3倍。朱崇淼等［10］研究厌氧真菌粗酶的木聚糖酶活力为7.89U／mL，刘焕明［11］报道，黑曲霉p14菌株木聚糖酶最优酶活力5.25 U／mL。Tripathi等［12］报道，12株厌氧真菌的羧甲基纤维素酶活力在160～231mU之间。这些结果均表明，瘤胃厌氧真菌是迄今所报道的产酶活力较高的菌株之一。

在试验中，以秸秆为发酵底物的的木聚糖酶活力为8.34 U／mL，稍低于国内已报道的链霉菌（streptomyces sp.str z-6）所产木聚糖酶活力（9.77 U／mL）［13］。羧甲基纤维酶活力为0.225U／mL，低于孟会生［14］和于红霞等［15］报道的结果。一方面说明在试验条件下，筛选发酵条件有进一步优化的可能性，另外一方面对于纤维素酶活力的检测应规范化，以便不同的研究的结果能有可比性。从发酵底物的干物质消失率看，干物质消失率最低的组（4组、5组和6组与木聚糖酶和羧甲基纤维素酶酶活力并不同步，说明还存在着没有被测定的纤维素酶，对纤维素的降解发挥着作用。5组的最高的木聚糖酶的比活力，进一步说明，该组的木聚糖酶的纯度高，则酶的种类相对少，在粗纤维降解上并无优势。

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