传统发酵豆制品中丙烯酰胺检测的HPLC-MS方法构建

张帅，梁桂娟，吴世兰，秦礼康

1(贵州大学，贵州贵阳，550025)2(贵州省产品质量监督检验院，贵州 贵阳，550003)

丙烯酰胺(acrylamide，AA)是一种不饱和酰胺［1］，食品中的丙烯酰胺之所以受到关注是因为它的毒性(俗称丙毒)。2002年4月，由瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学联合宣称，在食品中含有对人体具有潜在致癌性的丙烯酰胺，尤其是以薯条为代表的富含碳水化合物的高温油炸食品中含量最为丰富［2］。该问题引起了国际社会的高度重视，WHO/FAO把食品中的丙烯酰胺作为优先评估对象［3］。此外，丙烯酰胺已被证明具有神经毒性、基因毒性和生殖毒性［4－7］。

目前，对食品中丙烯酰胺的研究主要集中于高淀粉含量油炸食品、焙烤食品以及饮用水。有研究认为，高淀粉含量油炸食品、焙烤食品为高温、低湿的典型的Maillard反应体系，其反应产物一部分对食品色泽、风味的形成具有重要作用，但同时也产生了醛类、杂环胺等有害的中间产物，随后通过一系列复杂化学变化产生丙烯酰胺［1，8］。国内外测定食品中AA的方法一般采用 GC-MS、HPLC、HPLC-MS或 HPLC-MS/MS［9－12］。美国 FDA 发布了采用 HPLC-MS/MS，以13C3-丙烯酰胺为内标的同位素稀释技术测定食品中丙烯酰胺的含量［13－14］。

豆豉、腐乳、豆酱以及酱油等豆类传统发酵调味品，现已发展成为我国最具优势和特色的新兴产业。但是，产品发酵过程中易受原料品质波动、杂菌污染以及环境因素的影响，产品质量极难稳定，存在较大的安全隐患，如生物胺、病原微生物及其毒素等内源性污染物，这些都已成为高蛋白豆类发酵调味品工业的安全隐患因子。为有效评价发酵豆制品中AA的含量状况，研究发酵豆制品中产生AA的机理以及相应的控制措施，目前迫切需要建立稳定、准确、快速简便的测定发酵豆制品中AA的方法。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

丙烯酰胺标准品:纯度＞99.8%，美国Sigma公司;13C3-丙烯酰胺标准品，英国Cambridge Isotope Laboratories。甲醇、甲酸:色谱纯;超纯水;乙酸锌［Zn(CH3COO)2］，亚铁氰化钾［K4Fe(CN)6］:分析纯;PES 0.22 μm水相滤膜。腐乳、豆豉以及豆酱均购自于贵阳市花溪合力超市与佳宇超市。

1.2 仪器和设备

UPLC-TQD Waters高效液相四级杆串联质谱仪(美国Waters公司);6 mL 200 mg OASIS固相萃取柱(美国 Waters公司);X-22R冷冻离心机(美国BECKMAN公司);Multi Reax旋涡混合器(德国Heidolph公司);Milli-Q Academic超纯水系统(中国密理博公司)。

2 实验方法

2.1 标准溶液的配制

准确称取10 mg丙烯酰胺标准品，精确至0.01 mg，置于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，1～4℃低温保存作为储备溶液。分别配制0.01，0.05，0.1，0.2，1 μg/mL 的 AA 标准溶液，13C3-丙烯酰胺为内标，浓度为1 μg/mL。

2.2 样品处理

称取样品1.0 g于50 mL离心管内，加500 μL 1 μg/mL的内标液(13C3-AA)，加入20 mL石油醚，振荡15 min，弃去石油醚，反复操作2次。加乙酸锌与亚铁氰化钾各3 mL进行蛋白质的沉淀，加入超纯水定容至20 mL，振荡15 min，冷冻离心(4℃，3 600 r/min)15 min，过滤待用。HLB固相萃取柱(6 mL 200 mg OASIS)先用5 mL甲醇活化和5 mL超纯水平衡，然后吸取待用液2 mL缓慢通过HLB固相萃取柱，1 mL超纯水淋洗，最后用2 mL 40%甲醇水溶液(含有0.01%甲酸)洗脱，收集洗脱液。过0.22 μm水相滤膜，备用待测。

2.3 色谱条件

ACQUITY UPLC C18色谱柱(210 mm×20 mm，1.7 μm，美国 Waters公司);柱温:30℃;流速:0.2 mL/min;进样量:5 μL;流动相:超纯水-甲醇(99∶1，其中分别加入0.1%甲酸)。

2.4 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:MRM;离子源温度:120℃;脱溶剂气温度:350℃;定性、定量离子对，碰撞能量以及锥孔电压见表1。

表1 丙烯酰胺的质谱参数

2.5 结果计算

试样中AA含量的计算:

其中，X为样品中丙烯酰胺的含量，mg/kg;A为质谱仪测定的丙烯酰胺的含量，ng/mL;2为待用液过HLB固相萃取柱体积，mL;N为稀释倍数;R/%为回收率;m为样品质量，g。

计算结果保留3位有效数字。

3 结果与讨论

3.1 丙烯酰胺标准曲线回归方程

将 0.01，0.05，0.1，0.2，1 μg/mL 标准溶液依次进样，计算标准曲线的回归方程和相关系数。曲线回归方程(Y为响应值，X为试样质量浓度)Y=81.827 6X+415.248，相关系数 R=0.992 425，R2=0.984 907，该方法在0.01～1 μg/mL都有良好的线性。见图1。

图1 丙烯酰胺标准曲线图

3.2 样品前处理条件的优化

本实验以13C3-丙烯酰胺为内标，浓度为1 μg/mL，使用固相萃取柱进行萃取，其中洗脱液(甲醇水溶液)的浓度对回收率影响较大。实验选取3组样品，分别在洗脱液浓度为20%，40%，60%，80%下对回收率进行分析，结果见表2。

表2 不同浓度洗脱液对回收率的影响 %

3.3 液相色谱条件的优化

选择超纯水与甲醇(0.1%甲酸)作为流动相，发现流动相配比在超纯水与甲醇的体积比为99∶1的条件下峰形较其他参考条件下［15－17］峰形好，可以显著改善拖尾现象。由于丙烯酰胺在质谱仪中分解为正离子，因此，加入0.1%的甲酸，能显著提高响应强度。图2为不同流动相条件下的质谱图。图a流动相为超纯水-甲醇(95∶5，分别添加0.1%甲酸);图b流动相为超纯水-甲醇(99∶1，分别添加0.1%甲酸)。从图2可以看出，加大流动相中超纯水的比例，可以显著延长丙烯酰胺的出峰时间，从而有效分离目标峰与杂质峰。

3.4 质谱条件的优化

由于丙烯酰胺的相对分子质量较低，因此所得碎片离子质量也低。选择MRM方式进行定量检测时灵敏度高，重现性好。通过预实验发现，母离子(m/z 72)通过脱氨能够得到子离子(m/z 55)，具有较高的相对丰度，当施加的碰撞能为12 eV时，达到最大值，当使用定性子离子(m/z 44)需要更大的碰撞能量，因此，选择m/z 55作为定量离子。丙烯酰胺的色谱图见图3。图a表示13C3-丙烯酰胺的质谱图，m/z为74.79∶58;图b表示丙烯酰胺定量时质谱图，m/z为72.2∶55;图c表示丙烯酰胺定性是质谱图，m/z为72.2∶44;图d表示总离子流图。

图2 不同流动相条件下质谱图的比较

3.5 方法精密度与加标回收率

以腐乳、豆豉、豆酱3种不同类型样品，加入1 mL 内标液(13C3-AA)，浓度分别为 1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.1 μg/mL。测得该方法的回收率范围，相对标准偏差(RSD)。测定结果见表3、表4和表5。从表中可以看出，腐乳的回收率在84.0%～88.3%，平均回收率为86.6%。豆豉的回收率在90.1%～93.1%之间，平均回收率为91.7%。豆酱的回收率在83.9%～87.4%，平均回收率为85.0%。它们的相对标准偏差(RSD)(n=5)均小于10%。因此，该方法可以用来分析测定腐乳、豆豉以及豆酱中丙烯酰胺的含量。

3.6 各样品中丙烯酰胺的含量

使用该实验方法，对不同地区不同品牌的豆豉、豆酱以及腐乳中的丙烯酰胺的含量进行了分析检测，结果见表6。

图3 13C3-丙烯酰胺内标物与丙烯酰胺标品测定的HPLC-MS图

表3 腐乳的回收率实验

表4 豆豉的回收率实验

表5 豆酱的回收率实验

表6 样品中丙烯酰胺的含量

从表6中的数据可知，在选取的豆豉样品中，丙烯酰胺的含量范围在1～15 mg/kg之间，豆酱在0.4～2 mg/kg之间，腐乳在2～8 mg/kg之间。豆豉中丙烯酰胺的含量明显高于腐乳与豆酱，而采用不同菌种进行发酵的豆豉中丙烯酰胺的含量也差异明显。

在表6中，编号1～6的样品发酵采用的菌种为曲霉，7～9为毛霉，10～14为细菌。可以看出，曲霉发酵的豆豉丙烯酰胺含量普遍偏高，毛霉型次之，细菌型普遍较低。

发酵豆制品中产生丙烯酰胺的途径可能有2种:

一是在生产加工过程原材料中还原糖和氨基发生的Maillard反应。在豆豉生产过程中，其中一步骤为蒸煮与冷却。此时的外界环境从高温转为低温，湿度很高，而伴随着原材料中本身含有的还原糖和氨基化合物，极有可能发生非典型Maillard反应，为丙烯酰胺的产生提供了物质基础，再通过随后的一系列化学反应产生丙烯酰胺。

二是由于其中微生物的生理生化过程中，在酶的作用下，产生了一系列丙烯酰胺的前体物质，如丙二醛、丁二酮、丙酮醛等，再反应形成丙烯酰胺。接种时曲霉型、毛霉型以及细菌型发酵豆豉的区别在于所接种的微生物类型不同。曲霉发酵的豆豉中曲霉类型主要有巢状亚属巢状组埃及曲霉(Aspergillus egyptiacus Moub.＆Moust.)，烟色亚属烟色组烟曲霉原变种(Aspergillus fumigatus)和环绕亚属黄绿组寄生青霉群(Aspergillus oryzae)［18］。毛霉发酵的豆豉所接种的主要以总状毛霉为主，但也有一定数量的枯草芽孢杆菌存在［19－20］。而细菌型豆豉则主要采用的是自然接种，参与的微生物主要有豆豉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌及微球菌［21］。在产生丙烯酰胺的第2种途径来看，可能由于各种微生物酶系的差异，导致发酵过程中外界环境所影响的自身酶系活力的差异，最终影响了丙烯酰胺的含量。

4 结论

本实验建立了使用HPLC-MS测定中国传统发酵豆制品中丙烯酰胺含量的方法。由于出峰时间短，样品前处理简便，使用电喷雾四级杆质谱仪MRM扫描方式灵敏度高，重现性好，能更好满足发酵豆制品中丙烯酰胺含量的测定。从丙烯酰胺测定的结果来看，由于饮用水是人体摄入丙烯酰胺的主要来源，许多国家规定饮用水中含量不能超过0.25 mg/kg，瑞典研究人员推定消费者食品中丙烯酰胺的平均暴露量为40μg/(人·d)［22］。从表6的测定结果来看，中国传统发酵豆制品中丙烯酰胺含量偏高，因此，其中丙烯酰胺产生的具体机理以及如何控制降低其含量还有待进一步的研究分析。

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