由天然叶黄素转化为玉米黄素的工艺参数的研究

陈 佳，陶正国，张贵林，余 勃，陆 豫*

1南昌大学药学系，南昌330006;2南昌大学中德联合研究院，南昌330047; 3广州立达尔生物科技有限公司，广州510530

叶黄素和玉米黄素均属于含羟基类胡萝卜素族，二者互为同分异构体。自然界中，叶黄素和玉米黄素大多同时存在，主要存在于深绿色食叶蔬菜、花卉、水果、枸杞和黄玉米中［1］。叶黄素的含量均远远大于玉米黄素含量，万寿菊提取物中大约82%～88%为叶黄素，只有3%～6%为玉米黄素［2］。研究表明，玉米黄素具有抗氧化、清除自由基 、延缓衰老、预防癌症、治疗老年黄斑病变和保护视觉等生理功能［3-9］。随着人们对健康的重视，使得玉米黄素受到广泛关注。

自从1947年Karrer和Jacker［10］将叶黄素在催化剂的作用下异构化为玉米黄素以来，研究者们在用叶黄素异构化为玉米黄素方面做了大量研究，但是转化率较低。本文对实验中的影响因素进行了优化，使转化率大大提高，提高工业效益。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

仪器:78-1型恒温磁力搅拌器(上海南汇电器厂);LC-15C型高效液相(岛津);

试剂:叶黄素(广州立达尔生物科技有限公司提供，含量85%以上)，玉米黄素标准品(北京依普瑞斯生物科技有限公司，纯度98%)，异丙醇，1，2-丙二醇，叔丁醇，1，4-二氧六环，聚乙二醇(PEG) 600，氢氧化钾、甲醇钠、叔丁醇钠、氨基钠均为分析纯。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件和转化率的测定

色谱柱:Alltech Alltima Silica(4.6×250 mm，5 um);流动相:正己烷:乙酸乙酯:异丙醇=75∶25∶1.5;流速:1.5 mL/min;柱温:室温;紫外检测波长:446 nm;进样量:20 μL。

转化率(%)=(原料中叶黄素含量-产物中叶黄素含量)/原料中叶黄素含量×100%

1.2.2 玉米黄素标准曲线的制作

精确称取3.0 mg玉米黄素标准品于50 mL容量瓶中，用适量丙酮溶解，用正己烷稀释至刻度，摇匀，得60 μg/mL的玉米黄素标准品溶液。取前一配好的玉米黄素标准品溶液于另一容量瓶中稀释至刻度，摇匀，得50 μg/mL玉米黄素标准品溶液。以此类推，分别配得40、30、20、10和1 μg/mL玉米黄素标准品溶液供做HPLC。以玉米黄素标准品浓度和HPLC峰面积为坐标，得玉米黄素标准曲线:y= 2.3246x+9.7721，R2=0.9943。

1.2.3 实验步骤

向通氮气保护的三口烧瓶中加入一定量的溶剂、PEG600和叶黄素，待叶黄素完全溶解后，再加入碱。加热至一定温度，开始反应。反应数小时至反应结束。加水，用25%醋酸中和，减压抽滤，真空干燥，得玉米黄素。

取产物先用少量提取剂(正己烷∶甲苯∶丙酮∶无水乙醇=10∶7∶7∶6)溶解，再用正己烷稀释，HPLC检测。

2 结果与讨论

经预实验和文献报道，本文对碱和溶剂的种类进行了筛选。并对碱量、溶剂量、反应温度、反应时间四个因素进行优化。

2.1 最佳催化剂的选择

叶黄素在催化剂的作用下进行异构化，主要是用碱作为催化剂。本文采用碱作为催化剂，并对碱进行了筛选。

在氮气保护下，在三口烧瓶中加入10 mL叔丁醇、0.25 g PEG600和0.5 g叶黄素，待完全溶解后，分别用3 g的氢氧化钾、甲醇钠、叔丁醇钠和氨基钠作为催化剂在110℃下进行反应，HPLC跟踪检测。

图1 不同碱对转化率的影响Fig.1 The effect of different alkali on the conversion

从图1可以得出氢氧化钾做催化剂时在短时间内可达到最高的转化率，并且氢氧化钾相对廉价，适合工业化生产，故选用氢氧化钾。但是，在氢氧化钾催化下转化率不是很高，从HPLC中可以看出在反应24 h后由于叶黄素被破坏而致转化率开始下降。我们推测可能是由于溶剂对反应的影响，所以本文对溶剂也进行了筛选。

2.2 溶剂对转化率的影响

叶黄素在许多有机溶剂中的溶剂度较差，且不同溶剂对叶黄素在碱性条件下的稳定性也有较大影响。所以，合适的溶剂对转化率有较大影响，对此本文做了相关研究。

在氮气保护下，分别用10 mL异丙醇、1，2-丙二醇、叔丁醇和1，4-二氧六环叔丁醇做溶剂，再加入0.25 g PEG600和0.5 g叶黄素，待完全溶解后，加入3 g氢氧化钾在110℃下进行反应，HPLC跟踪检测。

图2 不同溶剂对转化率的影响Fig.2 The effect of different solvents on the conversion

从图2中可以得出1，2-丙二醇做溶剂转化率是持续升高的，这主要是由于在1，2-丙二醇中叶黄素几乎没有被破坏。另外，1，2-丙二醇的沸点较高，转化率有望进一步得到提高，且1，2-丙二醇对人体无毒害作用，所以本文选择1，2-丙二醇做溶剂。

2.3 氢氧化钾用量对反应速率和转化率的影响

在氮气保护下，在三口烧瓶中加入10 mL 1，2-丙二醇、0.25 g PEG600和0.5 g叶黄素，待完全溶解后，分别用氢氧化钾/叶黄素(m/m)为1、2、3、4、5、6、7的催化剂与底物比在110℃下进行反应，HPLC跟踪检测。

图3 氢氧化钾量对转化率的影响Fig.3 The effect of the amount of potassium hydroxide on the conversion

从图3中可以看出在氢氧化钾/叶黄素小于7时，随着氢氧化钾用量的增加，转化率也相应增大，这时氢氧化钾的催化作用占主导。当氢氧化钾/叶黄素为7时，转化率较快出现下降，这时氢氧化钾对叶黄素的破坏作用占主导。所以，氢氧化钾用量的选择为氢氧化钾/叶黄素为6时转化率最高，反应时间也相应较短。

2.4 1，2-丙二醇用量对反应速率和转化率的影响

在氮气保护下，在三口烧瓶中加入 0.25 g PEG600、0.5 g叶黄素和3 g氢氧化钾，分别用1，2-丙二醇/叶黄素(v/m)为10、20、30、40溶剂与底物比在110℃下进行反应，HPLC跟踪检测。

图4 1，2-丙二醇用量对转化率的影响Fig.4 The effect of the amount of 1，2-Propanediol on the conversion

从图4中可以看出，当1，2-丙二醇/叶黄素(v/ m)为10时，转化率较低，可能是因为叶黄素在1，2-丙二醇中没有完全溶解。当1，2-丙二醇/叶黄素大于10时，转化率有所增加，当1，2-丙二醇/叶黄素为20时转化率最高。1，2-丙二醇/叶黄素大于20时，转化率有所下降，这是由于底物浓度降低，催化剂与底物的碰撞几率降低，转化率和反应速率降低。所以，1，2-丙二醇/叶黄素选择20。

2.5 温度对转化率的影响

温度对反应有很大的影响，又由于叶黄素和产物玉米黄素对温度也较为敏感，所以，选择合适的反应温度对反应的进行尤为重要。

在氮气保护下，在三口烧瓶中加入10 mL 1，2-丙二醇、0.25 g PEG600、0.5 g叶黄素和3 g氢氧化钾，反应液分别在90、100、110、120和130℃下进行反应，HPLC跟踪检测。

图5 温度对转化率的影响Fig.5 The effect of temperature on the conversion

从图5中可以看出当温度在110℃时，转化率处于上升趋势且能达到最大。当温度继续升高时，高温对叶黄素和玉米黄素的破坏作用占主导地位，转化率降低。所以，最适反应温度选择为110℃。

2.6 时间对转化率的影响

由于叶黄素和玉米黄素对温度和碱都不稳定，反应时间过长，叶黄素和玉米黄素均会被破坏，所以，需确定最佳反应时间。

在氮气保护下，在三口烧瓶中加入10 mL1，2-丙二醇、0.25 g PEG600、0.5 g叶黄素和3 g氢氧化钾，在110℃下进行反应，HPLC跟踪检测。

图6 反应时间对转化率的影响Fig.6 The effect of reaction time on the conversion

从图6中可以看出，当反应时间为168 h时，转化率最高。

2.7 其它因素对转化率的影响

除了以上研究的六个因素对叶黄素的转化有重大影响外，还有诸如搅拌速度、碱的状态等因素对反应的进行有一定的影响。

2.7.1 搅拌速度对转化率的影响

由于此反应是在两相中进行的，因此，需要一定的搅拌速度来增加分子间的碰撞几率。搅拌速度越快，分子间的碰撞几率越大，反应速率越快。一般，搅拌速度大于40 rpm，有利于反应。

2.7.2 碱的状态对转化率的影响

在此反应中，碱的存在形式可以是固体的也可以是水溶液，碱不同的状态对反应有一定的影响。在本实验中，不含水的固体氢氧化钾的催化效力大于氢氧化钾水溶液。

2.8 玉米黄素表征

图7 反应前HPLC谱图Fig.7 The HPLC chromatogram before reaction

经实验对反应条件的优化，以1，2-丙二醇为溶剂，氢氧化钾为催化剂，当1，2-丙二醇/叶黄素为20，氢氧化钾/叶黄素为6，反应温度为110℃，反应时间为168 h。从图7中可以看出叶黄素的保留时间是12.989 min，玉米黄素的保留时间是15.121 min，图8与图7保持一致。检测叶黄素转化为玉米黄素的转化率为93%。

图8 反应后HPLC谱图Fig.8 The HPLC chromatogram after reaction

致谢：非常感谢南昌大学分析测试中心对本研究项目给予的测试基金支持，对本实验有过帮助的人及单位在此一并感谢。

1 Lu YJ(卢艳杰)，Chen ZX(陈正行)，Yao HY(姚惠源).I-solation and identification of lutein and zeaxanthin from corn gluten by thin-layer chromatography.J Wuxi Univ Light Ind (无锡轻工大学学报)，2003，22(5):11-15.

2 Gustavo Rodriguez，Pigmenting efficiency of natural xanthophyll by isomerization.US5973211，1999-10-26. 3 Olmedilla B，Granado F，Blanco I，et al.Lutein in patients with cataracts and age-related macular degeneration:a longterm supplementation study.J Sci Food Agric，2001，81:904-909.

4 Snodderly DM.Evidence for protection against age-related macular degeneration by carotenoids and antioxidant vitamins.Am J Clin Nutr，1995，62，1448S-1461S.

5 Schalch W，Dayhaw-Barker P，Barker FM.The carotenoids of human macula in nutritional and invironmental influences on the eye.A.Ed.CRC Press:Boca Raton，1999.215-250.

6 Karaaukhov VN.Review:Carotenieds recent progress problems and prospects.Comp Biochem Physiol B，1990，95:1-20.

7 Sun Z(孙震)，Yao HY(姚惠源).Effects of molecule structure modification of lutein and zeaxanthin on inhibitory tumor cell proliferation activity.Food Sci(食品科学)，2007，28: 296-301.

8 Lu X(吕欣)，Mao ZG(毛忠贵).Research progress of corn pigments.J Cereals＆Oils(粮食与油脂)，2003，(4):43-44.

9 Liu Y，Conrad OP，Suresh V.Comparison of three chosen vegetables with others from South East Asia for their lutein and zeaxanthin content.Food Chem，2007，101:1533-1539.

10 Karrer P，Jucker E.Umwandlung von α-Carotin in β-Carotin und von xanthophyll in zeaxanthin.Helv Chim Acta，1947，30:266-267.