人乳腺癌细胞株 MCF-7、MCF-7/ADM细胞迁移能力的对比研究

陈平 李克强 毛联钢 乐东海 冯伟云

人乳腺癌细胞株 MCF-7、MCF-7/ADM细胞迁移能力的对比研究

陈平 李克强 毛联钢 乐东海 冯伟云

目的 探讨乳腺癌细胞化疗继发耐药后细胞迁移能力的变化，并筛选出相关基因。 方法 以MCF-7细胞株为亲本细胞，采用阿霉素（ADM）低浓度持续加量诱导法建立对ADM耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/ADM。应用ATP-TCA药物敏感检测法和xCELLIigence/RT-CES实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM对多种化疗药物的耐药情况。应用Transwell实验和xCELLIigence/RT-CIM实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM的细胞迁移能力。应用比较基因组芯片筛选出人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM DNA拷贝数4倍差异的基因。 结果 撤药培养150d后，MCF-7/ADM细胞较亲本细胞MCF-7的ADM耐药指数为72.9倍，对其他化疗药物无明显的交叉耐药性。MCF-7/ADM细胞迁移能力较MCF-7明显降低（P＜0.05）。MCF-7/ADM有12种基因DNA拷贝数是MCF-7的4倍，MCF-7有6种基因DNA拷贝数是MCF-7/ADM的4倍。 结论 乳腺癌细胞化疗继发耐药伴随细胞迁移能力明显降低，其相关基因的DNA拷贝数亦有明显差异。

乳腺癌 阿霉素 化疗耐药 细胞迁移

蒽环类化疗药物作为乳腺癌化疗中最常用的药物，无论在乳腺癌术前新辅助化疗、复发转移解救治疗和早期乳腺癌术后辅助治疗中都占有非常重要的位置。MCF-7是一种体外实验常用的乳腺癌细胞株。先前学者大多单独进行乳腺癌的耐药研究，对于肿瘤细胞继发耐药之后的其他相关功能研究较少，尤其对于肿瘤细胞继发耐药之后的转移能力缺乏研究。本研究采用阿霉素（adriamycin，ADM）诱导耐药，获得MCF-7/ADM继发耐药细胞株，观察耐药细胞株和亲本细胞株之间细胞迁移能力的差异，筛选出相关基因，为临床提供帮助。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺细胞株MCF-7引自中科院上海细胞库。RPMI 1640购于Gibco公司。胰蛋白酶、DMSO和小牛血清购于华美生物工程公司。5-氟尿嘧啶（5-FU）购于浙江海正药业股份有限公司，ADM购于日本化药株式会社，多西紫杉醇（TXT）、紫杉醇（PTX）、泽菲（GEM）购于江苏恒瑞医药股份有限公司。Agilent CGH human 244K芯片购于上海芯超公司。Transwell购于美国Corning公司，xCELLIigence/RT-CIM与xCELLIigence/ RT-CES系统购于罗氏公司。

1.2 方法

1.2.1 MCF-7/ADM的建立 采用低浓度加量持续诱导法诱导亲本MCF-7细胞株。以ADM对亲本MCF-7IC50（杀伤50%肿瘤细胞所需药物浓度）的1/10为起始浓度，逐步提高细胞培养液中的ADM浓度，待每个ADM浓度时细胞稳定生长后再逐步提高药物浓度，同步监测ADM对细胞的IC50。

1.2.2 ATP-TCA法检测细胞耐药性 取单细胞悬液，接种96孔培养板，2×104个细胞/孔，加入抗肿瘤药物（X组），每种药物参照制药商的说明书或药典中的化疗药物血浆峰值浓度（PPC），设定5个药物测试浓度（TDC）：200.0%、100.0%、50.0%、25.0%、12.5%PPC。每个浓度设2个平行孔；另外设2个对照组，一个无药对照组（M0组），一个抑制最强组（Mi组）。培养板在37℃，5%CO2培养3～4 d后，用化学发光扫描仪测定发光强度，计算出平均值。抑制率=[1-（X-Mi）/（M0-Mi）]×100%（注：X、M0、Mi分别为3组的荧光强度抑制率），可用荧光扫描仪自带软件计算出IC50。按下式计算耐药指数（resistance index，RI），RI=耐药型细胞（MCF-7/ADM）IC50/野生型细胞（MCF-7）IC50，将MCF-7/ADM细胞撤药后常规培养并传代，跟踪检测ADM的IC50，求出RI值。

1.2.3 xCELLIigence/RT-CES系统检测细胞增殖能力 在干净无菌的E-plate中,每孔加入100 μl完全培养液，按要求放入仪器（仪器置于细胞培养箱中），读取培养液的背景数据。之后，取出E-plate。在超净工作台中接种预先制备的细胞悬液，每孔接种8×103个细胞，将E-plate再次放入仪器静置30min。设置监测参数，共监测100h，每隔15min监测1次，可以观察到细胞贴壁及对数增长的曲线，通过细胞指数（cell index，CI）值反应细胞增殖情况。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移能力 取所需数量小室于一空24孔板中，加100μl无血清培养基到小室内，培养箱放置1～2h。将处于对数生长期的各组细胞用胰酶消化下来，小心移去小室内培养基，加600μl含30%FBS（血清浓度可以根据需要调整）培养基到下室中。用无血清培养基按一定比例稀释细胞，加该细胞悬液（含1×105～2×105个细胞）100μl到每个小室中，将小室转移入含30%FBS培养基的下室中，培养箱放置4～24h。倒扣小室于吸水纸上去除培养基，用棉拭子轻轻移去非转移细胞，加400μl染色液到24孔板的空孔中，将小室浸泡染色液中20min，在膜的下表面染色转移细胞，蒸馏水中浸泡小室，冲洗数次，晾干后显微镜下观察。用10%醋酸脱色，测定洗脱液OD570值，间接反映发生细胞迁移的细胞数。

1.2.5 xCELLIigence/RT-CIM系统检测细胞迁移能力 将MCF-7和MCF-7/ADM细胞分别放于不含血清培养基中生长，并生长4～24h。将培养基加入至底层小室，将顶层小室置于底层小室上面，并将两者扣合在一起，以进行CIM-Plate 16的装配。在获得背景测定前，将不含血清培养基放置于顶层小室中进行水合处理，并将过滤膜放置于CO2孵育箱中，37℃，1h，进行预孵育处理。于不含血清培养基中对细胞进行轻柔的胰酶消化处理，使细胞成团状，然后再重新悬浮细胞。对CIM-Plate 16进行平衡处理后，将CIM-Plate 16放置于RTCA DP仪器工作站中，并进行背景细胞指数值测定。然后从RTCA DP仪器站中移除CIM-Plate 16，并将细胞加入至顶层中，细胞密度为理想密度。将CIM-Plate 16放置于RTCA DP仪器站中，并在几小时内，每隔2 min对细胞迁移情况进行监测，细胞信号的强弱代表发生细胞迁移的细胞数量。按上述方法分别检测MCF-7在0、25%、50%、100%、200%PPC，MCF-7/ADM在0、500%、1 000%、2 000%、4 000%PPC时细胞迁移能力。

1.2.6 细胞DNA拷贝数变化检测 实验标记方法采用Agilent标记方法，各取1.5μg探针进行标记杂交，杂交方法采用65℃，40h滚动杂交，并在室温洗片。芯片结果采用Agilent扫描仪进行扫描，Feature Extraction软件读取数据Scanresolution 5μm,PMT 100%，最后采用Feature Extration进行Normalize处理分析。CGH Analytics软件分析数据，以Z-scoring算法分析，取Window值为1M，Threshold值为4，筛选出乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM DNA拷贝数4倍差异的基因。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，计量资料以表示，两样本间比较采用t检验。

2 结果

2.1 MCF-7与MCF-7/ADM细胞耐药性比较 详见表1。

由表1可见，MCF-7/ADM细胞较之亲本细胞MCF-7，对ADM的IC50明显升高（P＜0.01），RI达72.9倍，但对其他化疗药物无明显交叉耐药性，IC50的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 MCF-7与MCF-7/ADM细胞耐药性比较

2.2 xCELLIigence/RT-CES系统检测MCF-7/ADM与MCF-7细胞体外增殖情况 MCF-7在ADM 50%PPC作用下增殖能力明显下降，而MCF-7/ADM在ADM 1 000% PPC作用下增殖能力未受到影响，详见图1、2。

2.3 Transwell实验检测MCF-7/ADM与MCF-7细胞迁移能力 细胞接种于上室培养24h染色后于显微镜下观察，MCF-7/ADM与MCF-7细胞组均有细胞穿过小室滤膜，但MCF-7/ADM细胞组（图3）较之MCF-7细胞组（图4）穿膜细胞数明显减少，两组间OD570的差异有统计学意义（P＜0.05），详见图5。

图1 MCF-7细胞在ADM作用下的增殖情况

图2 MCF-7/ADM细胞在ADM作用下的增殖情况

2.4 xCELLIigence/RT-CIM系统检测MCF-7/ADM与MCF-7细胞迁移能力 结果表明MCF-7/ADM较之亲本MCF-7细胞迁移能力明显下降。MCF-7细胞组从22h开始细胞信号达到平台期，表示MCF-7细胞组22h细胞迁移即全部完成；而MCF-7/ADM细胞组经过60h，细胞信号仍未达到平台期，表示MCF-7/ADM细胞组60h尚有部分细胞未完成迁移，详见图6。

图3 MCF-7/ADM细胞Transwell检测（×100）

图4 MCF-7细胞Transwell检测（×100）

图5 MCF-7/ADM细胞与MCF-7细胞的OD570比较

图6 MCF-7/ADM与MCF-7细胞迁移动态图

2.5MCF-7/ADM与MCF-7细胞DNA拷贝数变化 MCF-7/ADM有12种基因DNA拷贝数是MCF-7的4倍：TEDDM1，CARF，OR2D2，GINS2，LZTR1，THAP7，CEBPA，FLJ90680，TST，MPST，LGALS1，DDX53；MCF-7有6种基因DNA拷贝数是MCF-7/ADM的4倍：KFZp686I15217，KAAG1，ISG20，C15orf42，CIRBP，XBP1。

3 讨论

乳腺癌是我国最常见的恶性肿瘤，化疗耐药和转移复发是乳腺癌难以根治的主要原因。先前学者在乳腺癌化疗耐药和转移复发方面做了大量的工作，但对化疗耐药和转移复发关联性研究的较少。

化疗耐药分为原发性耐药和继发性耐药。有学者认为[1]，肿瘤细胞中有一细胞亚群对化疗具有先天性耐药的能力，将此类肿瘤细胞先天具有对化疗的耐受现象称之为原发性耐药。还有一类肿瘤细胞在高浓度的化疗药物的作用下死亡，而当较低浓度的化疗药物反复作用下其获得性的对该种药物产生耐受，其所获得的耐药性能在更高浓度的同种或另种化疗药物作用下获得存活，将此类肿瘤细胞后天获得对化疗的耐受现象称之为继发性耐药。ADM是恩环类抗癌药物中的经典药物，能与乳腺癌细胞DNA交叉、联结、抑制DNA复制，并阻断RNA聚合酶的作用，抑制RNA的合成。张涛等[2]应用三磷酸腺生物荧光体外药物敏感检测法（ATP-TCA）发现乳腺癌对ADM的原发耐药率为33%。李艳芬等[3]应用ATP-TCA法检测发现乳腺癌对表ADM的原发耐药率为37.3%。由此可见，乳腺癌对ADM和表阿霉素的耐药主要为继发性耐药。

有学者在乳腺癌细胞迁移实验中观察到ADM继发性耐药细胞MCF-7/ADM较之亲本乳腺癌细胞MCF-7迁移能力明显降低[8]。在本研究中，通过低浓度加量持续诱导法诱导MCF-7/ADM耐药细胞株，同时通过ATP-TCA检测法和xCELLIigence/RT-CES实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ ADM对多种化疗药物的耐药情况，结果显示MCF-7/ ADM较之MCF-7细胞对ADM明显耐药。同时应用Transwell实验和xCELLIigence/RT-CIM实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM的细胞迁移能力，结果显示MCF-7/ADM较之MCF-7细胞迁移能力明显降低。

有研究表明，化疗耐药细胞其发生转移的情况较多，也就是说化疗耐药细胞往往转移能力也较强[8]。而本研究中MCF-7/ADM较之MCF-7细胞迁移能力明显降低，这与我们传统的认识具有一定的差距。

转移是一个极其复杂的生物学过程，我们通常都将肿瘤转移过程简单地分为以下几个步骤，即局部浸润、渗入血管、随血液循环系统转移并在其中存活、移出血管、在新的部位定居并增殖。当受到外界信号刺激，细胞间黏附能力降低，癌细胞获得迁移表型，从原发部位脱离，同时在细胞外基质蛋白酶的作用下降解基底膜，进入血管或淋巴管中游走，抵达特定靶器官形成远端转移灶。癌细胞的迁移虽然是癌转移的重要步骤，但整个转移的过程中步骤和影响因素很多，虽然细胞迁移能力下降，但是由于肿瘤细胞增殖和耐药能力的提高，最终肿瘤细胞转移能力却提高了。

先前关于转移相关基因的研究较多，其中有Rho GTPases、WAVE、LIMK1[4-6]。国内外研究已经证实PI3K/ AKT信号转导通路在乳腺癌的细胞迁移和化疗药物紫杉醇、ADM及2，2一二氟脱氧胞嘧啶核苷的耐药中扮演重要的角色[7-8]。

本研究中，采用比较基因组芯片技术，检测了MCF-7/ADM和MCF-7细胞基因组DNA拷贝数的差异，MCF-7/ADM基因组是MCF-7基因的4倍有12种：TEDDM1，CARF，OR2D2，GINS2，LZTR1，THAP7，CEBPA，FLJ-90680，TST，MPST，LGALS1，DDX53；MCF-7/ADM基因组是 MCF-7的 4倍有 6种：KFZp686I15217，KAAG1，ISG20，C15orf42，CIRBP，XBP1。

[1] 徐兵河.肿瘤化疗药物耐药的概念与现状[J].中国医刊,2005,40(11): 652-656.

[2]张涛,张保宁,张伟,等.ATP生物荧光肿瘤体外药物敏感性检测在乳腺癌中的应用[J].肿瘤防治研究,2004,31（12）:765-767.

[3]李艳芬,田海梅,陈国际,等.人乳腺癌细胞原代培养体外药敏试验研究[J].临床肿瘤学杂志,2006,11(10):768-771.

[4]王妍,张莲芬,冯磊,等.人乳腺癌细胞系MCF-7/W和MCF-7/ADM细胞中阿霉素结合蛋白的分析[J].中国药理学通报,2007,23(9):1188-1193.

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Comparative analysis of cell migration of human breast cancer cell line MCF-7 and MCF-7/ADM

Objective To investigate the change of the cell migration ability of breast cancer cells with acquired resistance to chemotherapy,and screen the related genes.Methods MCF-7 cells were used as the parental cells,and human breast cancer cell line MCF-7/ADM were established with continuous low concentration of ADM.The chemotherapy resistance of MCF-7 and MCF-7/ADM cell was detected by ATP-TCA drug sensitive test and xCELLIigence/RT-CES real-time cell electronic analysis system.The cell migration of MCF-7 and MCF-7/ADM cell was detected by Transwell test and xCELLIigence/RT-CIM real-time cell electronic analysis system.4 times the difference of DNA copies of Genes in MCF-7 and MCF-7/ADM cell were screeninged by comparative genomic chip. Results The drug resistant index of MCF-7/ADM cell kept on 72.9 times over MCF-7 cell after cultured in the medium(without ADM)for 150 days.MCF-7/ADM had no obvious cross-resistance to other chemotherapy drugs. The cell migration of MCF-7/ADM reduced significantly than that of MCF-7(P＜0.05).The DNA copies of 12 genes of MCF-7/ADM cell are 4 times more than that of MCF-7,while the DNA copies of 6 genes of MCF-7 cell are 4 times more than that of MCF-7/ADM. Conclusion The migration ability of breast cancer cells was significantly reduced with acquired chemotherapy resistance，and the DNA copies of some genes are also obvious different.

Breast cancerADM Chemotherapy resistance Cell migration

2013-07-08）

（本文编辑：严玮雯）

宁波市自然科学基金项目（2009A610179）

315000 宁波市第二医院普外科

李克强，E-mail：chasejxmc@163.com