类风湿关节炎患者血清中抗环瓜氨酸肽抗体不同亚型的临床意义

杨清萍

类风湿关节炎患者血清中抗环瓜氨酸肽抗体不同亚型的临床意义

杨清萍

目的 检测类风湿关节炎（RA）患者血清中不同亚型的抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体，探讨其在RA中的相关临床意义。方法 采用ELISA法检测135例RA患者、53例非RA的其他结缔组织病（CTD）患者和45例健康体检者血清中抗CCP抗体-IgA、IgG和IgM，并用比浊法检测类风湿因子（RF）-IgM。 结果 RA患者血清中的抗CCP抗体-IgA、IgG、IgM的检出率分别为57.8%、73.3%、30.4%，均高于CTD组和健康对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。RA患者的RF-IgM阳性者中的抗CCP抗体-IgA、IgG、IgM的阳性检出率均高于RF-IgM阴性者（P＜0.05）。抗CCP抗体-IgA、IgG亚型在≥24个月、7～23个月病程组中的阳性率高于≤6个月组（P＜0.05），但≥24个月与7～23个月阳性率的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。抗CCP抗体-IgM在≥24个月的阳性率低于≤6个月组（P＜0.05），但7～23个月与≥24个月、≤6个月病程组间的阳性率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。抗CCP抗体-IgA、IgM对RA的诊断敏感度均低于抗CCP抗体-IgG，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而抗CCP抗体-IgA、IgM的诊断特异度分别与抗CCP抗体-IgG的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。 结论 RA患者血清中存在不同亚型的抗CCP抗体，抗CCP抗体-IgA、IgM在RA诊断中与IgG亚型有相似的诊断特异度。

类风湿关节炎 抗环瓜氨酸肽抗体 亚型

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种原因不明的系统性自身免疫性疾病，对称性累及外周关节的持续性滑膜炎是其特征性表现，此外常导致多系统的临床表现。抗环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗体作为RA的特异性抗体，已成为新的RA分类诊断标准中的血清学标志[1]，且抗CCP抗体在RA的早期诊断[2]、预后判断[3]及发病机制[4]中起重要的作用。目前，临床实验室对于抗CCP抗体的检测通常针对其IgG亚型，而抗CCP抗体-IgA、IgM亚型在国内却较少有报道。因此，笔者通过检测RA患者血清中不同亚型的抗CCP抗体，以探讨其在RA中的相关临床意义。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2011-05—2012-12本院门诊和住院RA患者135例，男33例，女102例，年龄14～74岁，平均（46±14）岁。其中病程≤6个月28例，7～23个月46例，≥24个月61例。上述所有患者的临床诊断均符合RA的分类标准[1]。选择同期在本院门诊和住院的其他结缔组织病（CTD）患者53例，男13例，女40例，年龄14～73岁，平均（47±14）岁。其中系统性红斑狼疮（SLE）27例，干燥综合征（SS）18例，多发性肌炎/皮肌炎（PM/ DM）3例，系统性硬化症（SSc）5例。所有患者的临床诊断均符合相关诊断标准。选择同期在本院体检中心健康体检者45例，无感染性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤，男12例，女33例，年龄18～72岁，平均（45±15）岁。3组患者一般资料的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法 所有研究对象真空采血3ml，经离心分离后血清标本分装2份，-80℃冻存备用，一次冻融后测定。

1.2.1 抗CCP抗体-IgA、IgG、IgM检测 抗CCP抗体-IgG采用德国欧蒙医学实验诊断股份公司提供的ELISA检测试剂盒，在相应微孔板中分别加标准品（Cal 1、Cal 2、Cal 3、Cal 4、Cal 5）、阳性对照、阴性对照及1∶101稀释后待检血清各100μl，室温下孵育30min。用300μl洗涤缓冲液洗涤3次。相应微孔中分别加100μl酶结合物，室温下孵育30min。用缓冲液同前洗涤；加100μl/孔底物，室温避光15min；再加100μl/孔终止液，以450nm为检测波长，620nm为参考波长在Sunrise酶标仪（瑞士Tecan公司）上检测吸光度（A）值。以试剂盒中的相应标准品作出标准曲线，以≥5U/ml判断为阳性。所有样本均检测复孔，每板均设空白、阴阳性对照。抗CCP抗体-IgA、IgM采用德国欧蒙医学实验诊断股份公司提供的ELISA检测试剂盒（其中酶标记二抗从公司另购），实验操作过程与抗CCP抗体-IgG相似，以大于健康对照组A值的+2s 判断为阳性。

1.2.2 类风湿因子（RF）-IgM检测 采用德国Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH生产的BNⅡ全自动蛋白分析仪及其配套试剂，通过颗粒增强免疫散射比浊法检测血清中的RF-IgM含量，以≥15U/ml判断为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件。RA组与CTD组、健康对照组血清中抗CCP抗体不同亚型的阳性检出率以及RA患者RF-IgM阴、阳性组及不同病程组中的抗CCP抗体亚型的比较均采用四格表χ2检验。抗CCP抗体-IgA、IgM与IgG在RA组的检测敏感度和非RA组（包括CTD组和健康对照组）中的检测特异度采用配对资料的McNemar χ2检验。

2 结果

2.1 3组血清不同亚型抗CCP抗体及RF-IgM阳性检出率的比较 见表1。

表1 3组血清不同亚型抗CCP抗体及RF-IgM阳性检出率的比较[例（%）]

由表1可见，RA组与CTD组、健康对照组比较，4种抗体的检出率均明显增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 RA组RF-IgM阳性与阴性患者不同亚型抗CCP抗体阳性检出率的比较 见表2。

表2 RA组RF-IgM阳性与阴性患者不同亚型抗CCP抗体阳性检出率的比较[例（%）]

由表2可见，RA组RF-IgM阳性与RF-IgM阴性的比较，抗CCP抗体-IgA、IgG、IgM阳性检出率的比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 不同病程的RA患者血清中抗CCP抗体不同亚型的检出情况 见表3。

表3 不同病程的RA患者血清中抗CCP抗体不同亚型的检出情况[例（%）]

由表3可见，RA患者血清中抗CCP抗体-IgA、IgG在≥24个月、7～23个月病程组中的阳性率高于≤6个月组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但≥24个月与7～23个月阳性率的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。抗CCP抗体-IgM在≥24个月的阳性率低于≤6个月，差异有统计学意义（P＜0.05），但7～23个月与≥24个月、≤6个月阳性率的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 抗CCP抗体不同亚型对RA诊断的评价指标的比较 见表4。

表4 抗CCP抗体不同亚型对RA诊断的评价指标比较[例（%）]

由表4可见，抗CCP抗体-IgA、IgM对RA的诊断敏感度均低于抗CCP抗体-IgG，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而抗CCP抗体-IgA、IgM的诊断特异度分别与抗CCP抗体-IgG的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

RA是一种抗原驱动，T细胞介导的常见系统性自身免疫性疾病[5]，其确切的发病机制目前尚未完全明确，可能与多种遗传因素和环境因素共同作用所导致。RA患者体内存在多种自身抗体，如抗CCP抗体、RF、抗角蛋白抗体（AKA）、抗核周因子（APF）、抗聚角蛋白微丝蛋白抗体（AFA）、抗突变型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗体等[6]，这些抗体对于RA的诊断和预后判断具有重要意义，其中抗CCP抗体为抗瓜氨酸肽/蛋白抗体（anti-citrullinated peptide/protein antibodies，ACPA）中应用最为广泛的一种，自2000年由Schelleken等[7]人工合成环瓜氨酸肽，并成功采用ELISA检测出RA患者血清中的抗CCP抗体。目前对RA诊断公认的特异度和早期诊断的实验室指标在RA诊断中的敏感度为71.7%，特异度为95.2%[8]。上述数据也主要基于抗CCP抗体-IgG的检测结果，目前国内外在抗CCP抗体的检测试剂中也采用针对IgG亚型。对于抗CCP抗体的其他亚型检测（如IgA、IgM）在国内却较少报道，在国外也仅有少量研究报道其在RA中的检出情况及临床意义[9-12]。

本研究通过检测135例RA患者血清中的抗CCP抗体-IgA、IgG、IgM，分析其与RF-IgM、病程的相互关系，及其对RA诊断指标的评价，从而探讨抗CCP抗体不同亚型在RA中的相关临床意义，结果显示RA患者血清中的抗CCP抗体-IgA、IgG、IgM的检出率分别为57.8%、73.3%、30.4%，均高于CTD组和健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明RA患者血清中存在-IgA、IgG、IgM不同的抗CCP抗体，且以抗CCP抗体-IgG为主，与文献报道一致[10-12]。其中抗CCP抗体-IgA的检出率高于上述文献中的52.9%、43.3%和42.9%，抗CCP抗体-IgG、IgM的检出率与上述文献存在一定差异，可能由于遗传因素和环境因素的不同从而导致不同人群中抗CCP抗体不同亚型的检出率差异。对于抗CCP抗体不同亚型的产生，可能由于RA作为一种自身免疫性疾病，存在T、B淋巴细胞免疫调节异常和固有免疫异常，从而影响针对瓜氨酸肽/蛋白（抗CCP抗体靶抗原）的不同自身抗体亚型的形成和转换。同一抗体的不同亚型会形成不同的抗原抗体免疫复合物，从而可引起如补体激活及吞噬过程等不同的清除机制。

此外，在RA诊断传统的实验室指标RF的比较中，RA患者的RF阳性组中的抗CCP抗体-IgA、IgG、IgM的阳性检出率均高于RF阴性组（P＜0.05），说明RA患者抗CCP抗体不同亚型的产生与RF存在一定的联系，但两者针对不同的靶抗原产生的自身抗体，因此，确切的相互关系有待进一步的深入研究。而对于不同病程的RA患者血清中抗CCP抗体不同亚型的检出情况，抗CCP抗体-IgA与IgG相似，在≥24个月、7～23个月阳性率高于≤6个月组（P＜0.05），但≥24个月与7～23个月病程组间的阳性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。抗CCP抗体-IgM在≥24个月的阳性率低于≤6个月组（P＜0.05），但7～23个月与≥24个月、≤6个月病程组间阳性率的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究结果表明：（1）抗CCP抗体-IgA、IgG、IgM可存在于不同病程的RA患者中；（2）抗CCP抗体-IgM在不同病程中的持续存在，说明不断有针对抗CCP抗体的B淋巴细胞持续免疫反应。在抗CCP抗体不同亚型对RA诊断指标的评价中，抗CCP抗体-IgA、IgM对RA的诊断敏感度均低于抗CCP抗体-IgG（P＜0.05），而抗CCP抗体-IgA、IgM的诊断特异度与抗CCP抗体-IgG相似（P＞0.05），表明在IgA、IgG、IgM不同亚型的抗CCP抗体中，IgG亚型对RA诊断价值最高。

总之，RA患者血清中存在IgA、IgG、IgM不同亚型的抗CCP抗体，且以抗CCP抗体-IgG为主。对于不同病程中的抗CCP抗体不同亚型，可反映其特异性的免疫学反应。但不同亚型的抗CCP抗体是否与RA的活动性、预后、疗效及发病机制相关，却有待进一步深入研究。

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Clinical significance of the different subtypes of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in patient with rheumatoid arthritis

Objective To investigate the subtypes of the anti-cyclic citrullinated peptide(CCP)antibodies in patients with rheumatoid arthritis(RA)and its clinical significance.Methods The subtypes of anti-CCP antibodies including IgA,IgG and IgM were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)in patients serum samples of 135 patients with RA,53 patients with non-RA connective tissue diseases(CTD)and 45 healthy controls. Results IgA,IgG and IgM anti-CCP antibodies were present in 57.8%、73.3%and 30.4%of RA patients,and their diagnostic specificity was 96.9%,96.9%and 95.9%,respectively. The positive rate of IgA,IgG and IgM anti-CCP antibodies were significant higher than those in non-RA CTD and healthy controls (P＜0.05).The positive rate of IgA,IgG and IgM anti-CCP antibodies were more frequently in RA patients with positive rheumatoid factor(RF)-IgM than that in negative RF-IgM RA patients(P＜0.05).The positive rate of IgA,IgG anti-CCP antibodies in RA patients with disease duration≥24months and 6～24months groups were significant higher than those in≤6 group.The positive rate of IgM anti-CCP antibodies in≥24months group was significant lower than in≤6 group.There was no statistically significant difference(P＞0.05)between 6～24months group and≥24months group or≤6 group. Conclusion The subtypes of anti-CCP antibodies are common in patients with RA.IgA and IgM anti-CCP antibodies are similarly specific for RA as IgG anti-CCP antibodies.

Rheumatoid arthritis Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies Subtypes

2013-03-27）

（本文编辑：严玮雯）

314000 嘉兴市第一人民医院检验科

杨清萍，E-mail:yangqp001@sina.com