乳腺癌组织中差异性微小RNA的血清学表达分析

邵营波，张 晟，刘 艳，刘晶晶，张霄蓓，张 瑾

本文要点微小RNA(microRNA)具有较好的组织特异性，在不同肿瘤中具有特定的表达模式，并在乳腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中得到了证实。microRNA能够游离于细胞外，稳定存在于血浆或血清中，具备疾病分子生物标志物的某些特点。血清microRNA作为肿瘤标志物的研究仍存在许多问题，如血清microRNA所发挥的生物学功能尚未明确，血清和组织microRNA水平的相关性仍存在争议等。本研究针对上述血清microRNA成为乳腺癌肿瘤标记物进程中两个最棘手的问题进行分析，以探讨其作为乳腺癌早期判断生物学行为的生物学标志物的可行性和临床应用价值。本研究对上述问题的阐明，将有助于加快血清microRNA作为肿瘤生物标志物向临床转化的应用进程，为肿瘤早期诊断、判断生物学行为及预后评估提供新思路。本研究尚存在一些不足，如样本量较少、尚需在大规模样本研究中证实、仅针对4种microRNA等，在今后研究中，我们将进一步扩大样本量、扩大研究对象为整个microRNA表达谱、进一步探讨microRNA在乳腺癌早期诊断和预后判断中的价值。

微小RNA(microRNA)通过下调靶基因的表达而参与调节细胞的发育、增殖、分化和凋亡，在人类肿瘤的发生和发展中扮演重要角色[1-3]。microRNA不仅存在于组织细胞中，还丰富而稳定地存在于血清等体液中，肿瘤患者体内循环microRNA的表达谱存在特异性的改变，多项研究显示了血清microRNA作为肿瘤特异性诊断标志物的潜能，有些更表现出判断预后的能力，而且血清microRNA易于获得，早期即可检测[4]。本研究在前期乳腺癌组织microRNA差异表达谱筛选的基础上，针对4种表达差异明显的microRNA(miR-10b、miR-100、miR-155、miR-206)，探讨血清microRNA预测乳腺癌早期生物学行为的可行性和临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取天津医科大学附属肿瘤医院2011年3—10月经病理诊断明确的乳腺癌患者165例(乳腺癌组)，均为女性，年龄34～80岁。另选取同时期在我院体检的健康女性120例为对照组，年龄28～73岁。均为初次确诊患者，取血之前未进行手术、放疗、化疗及内分泌治疗。对照组均为未患有恶性肿瘤的年龄与乳腺癌组匹配的健康女性。本研究通过天津医科大学附属肿瘤医院伦理审查委员会审查通过。患者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 抽取外周静脉血6 ml置于不含抗凝剂的管中，静置30 min，室温,1 300×g(或4 000 r/min)离心15～20 min，取上层血清分装至RNAse-free EP管液氮速冻后置于-80 ℃冰箱储存。

1.2.2 血清样本总RNA的提取 采用Bioteke公司的血液样本总RNA快速提取试剂盒提取血清总RNA，血清的起始用量为500 μl，提取过程严格按照试剂盒说明书操作。纯化后的总RNA样本经紫外分光光度计进行定量检测，提取出的总RNA样本存储于-80 ℃。

1.2.3 cDNA的合成 使用microRNA cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)对已提取出的总RNA进行逆转录，合成cDNA。操作步骤主要包括microRNA 3′末端PolyA加尾处理和PolyA修饰的microRNA逆转录反应。

1.2.4 实时定量聚合酶链反应(real-time PCR) 应用microRNA茎环引物及PCR引物，内参基因选择U6，采用SYBR®real-time PCR detection kit荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)，利用real time PCR仪(CFX96 real time PCR,德国)进行扩增，并用分析软件分析PCR结果，从而得出各个microRNA的real-time PCR的CT值并绘制相应的扩增曲线和溶解曲线。样品目的基因的相对表达率(RQ)采用△CT方法计算[5]。

2 结果

2.1 目标microRNA在前期乳腺癌组织筛查中的表达情况 microRNA筛查及real-time PCR对筛查结果的验证，共筛选出10种差异性表达的microRNA，以差异表达量>2个fold、CT值<30作为标准，共筛选出4种microRNA，即miR-10b、miR-100、miR-155及miR-206。

2.2 对照组与乳腺癌组microRNA相对表达量比较 对照组与乳腺癌组miR-100、miR-155及miR-206相对表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组miR-10b相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

Table1 Comparison of relative content of microRNA between breast cancer group and control group

组别例数miR-10bmiR-100miR-155miR-206对照组1200 94±0 371 03±0 291 18±0 660 90±0 24乳腺癌组1650 92±0 420 58±0 322 88±1 120 75±0 22t值0 6942 6944 5482 371P值0 4700 0120 0010 010

2.3 乳腺癌患者血清microRNA相对表达量与乳腺癌临床病理特征间的关系 乳腺癌淋巴结转移阳性与阴性患者miR-10b相对表达量，不同临床分期、突变型P53阳性与阴性、Ki-67<14%与≥14%患者miR-155相对表达量和不同分子分型、雌激素受体阳性与阴性患者miR-206相对表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

3 讨论

肿瘤组织microRNA 表达谱与肿瘤发生及预后相关,但是检测技术复杂、创伤大，且必须在手术之后才能获得标本，难以真正应用于临床。2008年Lawrie等首次发现人血清中含有microRNA,紧随其后，Mitchell等[6]和Chen等[7]几乎同时报道人血浆或血清中存在稳定的microRNA。相比较而言,外周血血清较易获得和检测,临床应用便捷，易于推广，血清microRNA一经发现，便引起了研究者的极大兴趣。人们发现，microRNA不仅丰富而稳定地存在于血清等体液中，更重要的是其表达水平与疾病密切相关。在疾病状态下，microRNA表达谱与在组织细胞中一样，会发生特征性的改变。多项研究显示了血清microRNA作为肿瘤特异性诊断标志物的潜能，有些更表现出判断预后的能力，而且血清microRNA易于获得，早期即可检测，检测结果可用来早期预测肿瘤的生物学行为，从而为治疗方案的合理选择提供了参考[8]。

Table2 Relationship between serum expression of microRNA and the clinical and pathological profiles of breast cancer

例数miR-10bmiR-100miR-155miR-206年龄(岁) ≤60860 95±0 670 52±0 362 93±0 620 72±0 28 >60790 90±0 520 54±0 423 12±0 800 74±0 30 U值3133295630523269 P值0 4560 3850 4240 533临床分期 Ⅰ期400 97±0 560 46±0 302 55±0 890 73±0 43 Ⅱ期831 01±0 610 50±0 192 85±1 060 76±0 26 Ⅲ期421 17±0 450 51±0 433 22±0 920 67±0 22 H值5 3180 96814 2892 091 P值0 0630 6540 0010 352分子分型 LuminalA900 96±0 630 48±0 362 73±1 020 60±0 27 LuminalB181 02±0 490 52±0 202 82±1 160 62±0 21 TNBC221 12±0 500 49±0 373 13±1 200 72±0 30 HER2/neu350 97±0 410 49±0 132 77±1 420 79±0 33 H值4 2021 0633 1216 114 P值0 1200 5880 2540 040组织学分级 Ⅰ级370 91±0 390 51±0 242 90±1 660 71±0 12 Ⅱ级821 10±0 580 53±0 492 68±1 230 69±0 27 Ⅲ级460 93±0 400 57±0 232 80±0 920 74±0 34 H值3 3251 9884 0241 525 P值0 2150 3750 1890 430淋巴结转移 阳性671 37±0 450 61±0 413 00±0 950 59±0 33 阴性980 75±0 600 57±0 332 83±1 070 82±0 20 U值0311828652518 P值0 0010 5640 1320 062雌激素受体 阳性1080 94±0 560 44±0 323 11±1 120 60±0 34 阴性 57 0 96±0 550 47±0 463 03±0 840 74±0 26 U值3234306829612865 P值0 9200 6920 1200 035孕激素受体 阳性950 98±0 490 52±0 202 97±1 180 64±0 22 阴形700 90±0 570 48±0 372 68±0 920 69±0 46 U值3023316730473195 P值0 4610 5190 4870 540HER2/neu表达 阳性 53 1 03±0 590 55±0 303 16±1 090 76±0 30 阴性1120 92±0 620 48±0 343 02±0 870 69±0 32 U值3232305831053158 P值0 7830 3580 4640 646突变型P53 阳性990 88±0 610 56±0 313 32±0 920 67±0 28 阴性660 93±0 490 58±0 392 34±0 690 59±0 17 U值3094323027902967 P值0 3230 6490 0270 236Ki-67(%) <14 52 1 00±0 380 52±0 292 20±0 810 71±0 32 ≥141131 10±0 500 49±0 313 47±0 760 69±0 28 U值3129306703298 P值0 5330 4240 0010 605

目前推测血清microRNA主要来自于凋亡或坏死的细胞，细胞的主动释放以及循环细胞的裂解，但对于其真实来源尚不清楚。通过体外检测血清中microRNA 的表达情况，能否完全代表具有组织特异性的microRNA 在人体肿瘤内部表达的情况，仍存在争议。本研究在组织芯片筛选的基础上，对乳腺癌组织中差异性表达的microRNA进行血清学水平检测，结果表明，目标microRNA在乳腺癌组织和血清中的表达水平具有相关性，这说明乳腺癌患者血清中microRNA的水平可以反映乳腺癌组织中microRNA的表达状态，这也为血清作为乳腺癌患者组织中microRNA表达水平研究新的便捷标本来源提供了理论基础。

研究还发现乳腺癌患者血清中microRNA的水平与乳腺癌某些临床病理特征相关，其中血清miR-10b和miR-206可以分别用来早期预测乳腺癌患者淋巴结转移状态和雌激素受体状态，miR-155可以早期判断乳腺癌细胞的恶性程度、预测临床分期。Ma等[9]研究发现miR-10b在转移性乳腺癌细胞株中的表达明显升高，如在高转移能力的MDA-MB-231细胞株中miR-10b表达水平比非转移性乳腺癌细胞株MCF-7高50倍以上，推测miR-10b在癌细胞的转移过程中可能起着促进作用。对血清中miR-10b水平的研究发现，血清中miR-10b的水平与淋巴结状态相关，淋巴结转移阳性者血清miR-10b水平显著高于淋巴结转移阴性者，miR-10b这种表达模式使其可以用来早期预测乳腺癌患者淋巴结转移状态，为进一步制定合理的手术方案提供参考。miR-155是最早发现的具有促癌活性的microRNA,研究发现，miR-155通过多种机制参与乳腺癌的发生和发展[10-11]。本研究中血清miR-155与临床分期、突变型P53的表达以及Ki-67表达指数具有相关性，临床分期较晚、突变型P53阳性、Ki-67表达指数高的乳腺癌患者血清中miR-155水平更高，这说明miR-155参与了肿瘤细胞增殖、侵袭过程，因此血清中miR-155的水平可以用来早期判断乳腺癌细胞的恶性程度，同时在早期预测临床分期、判断预后方面也有很大的应用价值。乳腺癌细胞系实验已经证实，miR-206在乳腺癌中的表达水平和雌激素受体的表达呈负相关，雌激素受体阴性的MB-MDA-231细胞系中miR-206的表达水平要高于雌激素阳性的MCF-7细胞系[12]，而且miR-206抑制雌激素受体α而不影响雌激素受体β的表达这种独特的选择性作用特点使其很有可能成为一种新的内分泌治疗工具。miR-206在雌激素受体阳性的乳腺癌患者血清中下调更加显著，因此在一定程度上血清中miR-206的水平可以用来早期判断雌激素受体的状态，从而进一步预测乳腺癌患者内分泌治疗的疗效。

在不同类型的肿瘤中，miR-100的表达情况是不同的[13-15]，该指标在乳腺癌中鲜有报道，本研究表明乳腺癌组织血清中miR-100表达显著下调，这与组织研究结论一致，通过生物信息学的方法，对miR-100的靶基因进行了预测，结果表明miR-100的靶基因作用机制广泛，包括FGFR3、FOXA1、HOXA1、POSTN、SMAD7、VLDLR等，涉及癌基因、细胞周期、信号通路、细胞耐药等众多方面，而这些基因大都参与乳腺癌的发生和进展，miR-100通过对这些基因的调控可能在乳腺癌的发生发展中发挥重要的作用。本研究未发现miR-100与乳腺癌临床病理特征之间的关联，miR-100在乳腺癌中的作用机制仍需进一步研究。

综上所述，血清 microRNA 可以作为乳腺癌的生物标记物来指示肿瘤的临床病理情况，血清microRNA在乳腺癌早期预测生物学行为、预后评估等方面也有广阔的应用前景。

作者贡献：邵营波与张晟对此论文贡献均等；此课题由邵营波、张晟及张瑾共同设计；研究过程由邵营波、张晟、刘艳及刘晶晶操作完成；研究所用试剂及分析工具由刘晶晶和张霄蓓提供；数据分析由邵营波、张晟及刘艳完成；本论文写作由邵营波、张晟及张瑾完成。

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