耐盐乳酸菌和酵母菌强化技术对高盐稀态发酵酱醪品质的影响*

崔瑞迎，郑佳，何菲，张立强，杨松彰，黄钧，吴重德，周荣清，2，3

1(四川大学轻纺与食品学院，四川成都，610065)2(国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州，646000)3(四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川成都，610065)

酱油中复杂的营养及风味物质主要源于微生物对原料中蛋白质、淀粉及脂肪等的代谢作用［1］。不同种属微生物生理特性的差异是导致酿造酱油品质区别的主要因素之一。不同耐盐乳酸菌及酵母菌代谢生成的不同醇类、酯类赋予酱油不同的风味［2－4］。随着现代生物技术的发展，传统发酵食品的发展面临着前所未有的机遇和挑战，近年来，利用各种微生物菌株纯培养物或不同菌株混合培养物强化食品发酵已成为应用生物技术改造传统食品发酵业研究热点。Akolka等［5］应用 Halobacterium sp.改善鱼酱油产品质量的研究表明，将该菌悬液接种到酱醪中，不仅可明显缩短发酵周期，也显著改善鱼酱油风味。Yin等［6］在泡菜生产过程，应用Lb.pentosus和Leu.Mesenteriodies的共培技术显著降低了泡菜中亚硝酸盐的含量，同时使肠球菌等腐败菌的数量显著减少，产品风味和质量也有较大改善。本文首次报道了纯培养耐盐乳酸菌T.halophilus CGMCC 3792、主发酵酵母菌Z.rouxii CGMCC 3791和产香酵母菌C.versatilis CGMCC 3790对冷温酿造工艺［3］酱醪酿造过程中酸、醇、酯和酚等4类挥发性组分以及乙醇、4-乙基愈创木酚等酱油特色挥发性组分的影响规律，研究结果对认识乳酸菌、酵母菌的代谢作用及微生物共培改善酱醪品质具有重要借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 微生物

米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042:上海迪发酿造生物制品有限公司;酵母菌Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791和Candida versatilis CGMCC 3790:本实验室从百年老字号酿造企业的酱醪中分离，经26S rDNA和ITS区域序列测序、鉴定、命名并保藏于CGMCC;乳酸菌Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792:本实验室从百年老字号酿造企业的酱醪中分离，经形态、生理生化特性试验后经16S rDNA测序鉴定，保藏于CGMCC。

1.2 材料

大豆、小麦，本地农贸市场购买。

1.3 主要仪器与设备

酱醪发酵罐:不锈钢罐，自制，容积10 L;DHP-9162电热恒温培养箱:上海一恒科学仪器有限公司;酸度计:PHS-3C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司;固相微萃取头:CAR/PDMS(75 μm，Supelco，美国);气-质联用仪:Trace GC Ultra DSQ II(Thermo，美国)，配备HP-5MS(30.0 m ×250 μm ×0.25 μm，Agilent，美国)毛细管色谱柱。

1.4 实验方法

1.4.1 酱醪制备

［7］所述方法与步骤，将米曲霉沪酿3.042培养成麸曲种子，等比例加入蒸大豆、碎炒小麦，培养酱油曲。(1)浓度为25%的盐水冷却至5℃后，按1.8∶1(质量比)与酱油曲混合均匀，维持品温≤15℃，发酵30 d后，将品温逐渐提升至30℃，保温发酵，样品简称AC;(2)工艺条件同(1)，发酵起始时，接入T.halophilus CGMCC 3792的菌悬液，其菌体浓度为5×107CFU/g，样品简称AL;(3)工艺条件同(1)，发酵3 d时，接入Z.rouxii CGMCC3791菌悬液，其菌体浓度达4.5×106CFU/g，随后发酵4 d，接入C.versatilis CGMCC 3790菌悬液，其菌体浓度为5.5×106CFU/g，样品简称 AY。

1.4.2 挥发性组分的测定

(1)样品前处理:在检测前，冷冻的酱醪样品迅速用乳钵研磨至均匀酱状。

(2)测定方法及GC-MS条件:挥发性组分的萃取参考文献［8］采用 HS-SPME。GC-MS条件:初始温度40℃，保持5 min，以4℃/min升至100℃，然后以6℃/min升至220℃，保持8 min;进样口温度250℃;载气流速为1.0 mL/min;载气为高纯氦;离子源温度、连接口温度分别为230℃和250℃;EI电子能量为70 eV;质量扫描范围为35～400 amu。

(3)挥发性组分的鉴定及数据处理:待测样品的质谱图通过与标准谱库(NIST05)比对鉴定，匹配度大于800(最大值为1 000)的结果才予以报道。使用X-caliber软件系统对结果数据进行处理，采用峰面积归一化法确定各组分相对含量。挥发性组分相对含量以平均值±标准偏差(RSD)(n=3)。

2 结果与讨论

2.1 耐盐乳酸菌和混合酵母菌强化对酱醪挥发性组分的影响

图1中分别是发酵初始以及发酵125 d后的各酱醪利用HS-SPME/GC-MS检出的总离子流图谱。由图知，经125 d发酵后各酱醪挥发性组分的总离子图谱较初始酱醪有显著差异，且T.halophilus CGMCC 3792强化、混合Z.rouxii CGMCC 3791和C.versatilis CGMCC 3790强化对挥发性组分贡献作用差异明显。3种不同样品共检出45种挥发性组分，包括酸类(2种)、醇类(5种)、酯类(17种)、酮类(2种)、醛类(5种)、酚类(3种)、呋喃类(2种)、吡嗪类(2种)、其他(7种)等9类组分(表1)。与对照组酱醪相比，2种不同强化方式的酱醪中酸、醇、酚、呋喃和其他等5类组分的相对含量差异较大，而其余4类组分的相对含量接近。因酿造方法不同，本研究检出的组分中，除2-甲基丁酸、戊酸、乙醇、2-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、大马酮等19种组分外，其余组分与Sun等人［9］的结果稍有不同。

图1 酱醪挥发性组分总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in soy sauce moromi

酸、醇、酯等组分具有各自独特的香味［10］，其相对含量的不同将赋予酱醪不同的风味。AL中酸、醇、酮、呋喃、吡嗪和其他等6类组分的相对含量降低，酯、醛和酚等3类组分的相对含量增加(表1)。酚类组分的增加主要源于4-乙基愈创木酚相对含量的增加，4-乙基愈创木酚是酱油中重要的风味组分之一，是耐盐酵母的代谢产物［11］，迄今未见是T.halophilus的代谢产物。但是，AL中4-乙基愈创木酚的相对含量从4.29%提高到 11.19%，增加了1.6倍。T.halophilus CGMCC 3792纯培养物强化改善了栖息在酱醪中酵母菌的代谢环境有利于促进4-乙基愈创木酚的形成，还是乳酸菌自身代谢生成4-乙基愈创木酚，有待进一步探讨。酯类组分小幅增加，其中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等组分的相对含量显著增加，辛酸甲酯和己酸正己酯等组分的相对含量降幅较大。醇类组分中苯甲醇、苯乙醇相对含量增幅较大，又因其抑制了酱醪中酵母菌繁殖与代谢，使得乙醇等组分的相对含量减少。其他组分相对含量的降低则是萘、甲基萘和2，6－二叔丁基苯醌减少所致。就单组分而言，T.halophilus CGMCC 3792的强化作用使挥发组分中苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙酯、3-(甲硫基)-丙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲醛、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2，3-二氢苯并呋喃等的相对含量增加，且苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲醛、4-乙基愈创木酚等提高的相对含量大于30%。苯甲醛的焦糖味［12］、3-(甲硫基)-丙酸乙酯的黄瓜和水果香味［13］有益酱油独特风味的形成，4-乙基愈创木酚是酱醪的重要呈香物质之一，其相对含量的增加突出了酱醪的特殊香味。

AY中因Z.rouxii CGMCC 3791使乙醇发酵作用增强，抑制了杂菌的生长繁殖，其酸类组分的相对含量降低，醇类组分相对含量增加，尤其是苯乙醇的相对含量增高。酯类组分中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯组分的相对含量显著增加，长链脂肪酸乙酯(月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯等)也有一定幅度增加，虽然苯乙酸乙酯等组分有所降低，但与AL相比，酯类组分仍有较大增幅。AY中戊酸、2-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醛等相对含量增幅较大，且酯类多是大分子酯类，在赋予其酯香和酱香风味方面具有重要的作用。2-甲基丁醇具有水果香气(阈值为 16.0 μg/L)，1-辛烯-3-醇具有浓郁的蘑菇香气(阈值为 1.5 μg/L)［14－15］，癸酸乙酯(阈值为 200 μg/L)赋予酱油水果香气并带有舒适的醋味［16］。

对照组的酱醪中2-甲基丁酸、乙醇、乙酸异戊酯、辛酸甲酯、苯乙酸乙酯、糠醛、二氢-5-戊基-2(3H)-呋喃酮、四甲基吡嗪的相对含量较高。此外，在AL中并未检出邻苯二甲酸异辛酯和大马酮，而在其他两种酱醪中均有检出，苯甲醛二甲缩醛在AL、AY中检出，而对照组并未检出。由此可见，不同种类微生物菌株纯培养物强化酱醪发酵对改善酱油的风味有不同的改善作用。

表1 酱醪挥发性组分相对峰面积百分数Table 1 Relative peak area of volatile compounds in soy sauce moromi

续表1

2.2 主体组分、乙醇及4-乙基愈创木酚变化规律的研究

比较醇、酯、醛、酚等4类组分发酵过程的变化趋势(图2)知，从0 d至95 d的发酵过程中，3种类型酱醪中醇类组分呈现非单调增加的规律，AY较其他组变化显著，其中AL醇类组分变化最平缓(图2a)。酯类组分的变化为，在发酵初始阶段均减少，AY发酵15 d后迅速升高，35 d后增至小峰值，随后又减少，75 d时降至低谷，然后急速回升增大。对照组酱醪呈类似的变化规律，但发酵55 d时进入小低谷，随后呈现单调增加的变化趋势。AL则是发酵15 d时降至低谷，后稍有升高，稳定后呈现单调增加的变化规律(图2b)。分析醛类组分的变化规律知，2种强化方式酱醪的变化规律类似，发酵第55天时达到峰值，随时间延长，其相对含量逐渐减少，这可能与酯类及乙醇等组分的相对含量升高有关，对照组酱醪的变化幅度则相对较小(图2c)。3种类型酱醪的酚类组分的变化类似(图2d)，均呈升高-降低-趋于稳定的变化趋势，只是AL降幅较小，AY的降幅较大且迅速。

图2e和图2f分别表示3种不同类型酱醪乙醇和4-乙基愈创木酚在125 d发酵过程中的变化规律。乙醇呈非单调增加的变化趋势，且AL中，乙醇在整个阶段的变化幅度低于其他组。4-乙基愈创木酚则呈现单调增加的变化规律，在发酵125 d时，AL较其他组的相对含量显著增加。由此可见，对于T.halophilus CGMCC 3792是否具有分泌4-乙基愈创木酚的能力以及是否冷温工艺赋予该菌株合成4-乙基愈创木酚的能力需进一步探究。

图2 酱醪主体挥发性组分、乙醇及4-乙基愈创木酚的变化Fig.2 Changes of main volatile compounds，ethanol and p-ethylguaiacol in soy sauce moromi

3 结论

基于HS-SPME/GC-MS检测冷温酿造工艺AL和AY挥发性组分的研究结果表明，两种强化方式均使酱醪中酸类、呋喃和吡嗪类组分的相对含量降低，酯类和醛类组分的相对含量增加。二者区别在于，AL中醇类、酮类及其他组分的相对含量降低，而酚类组分的相对含量增加，AY中酚类组分的相对含量降低，醇类及其他组分的相对含量增加。对于酯类组分，AL中乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯组分的相对含量显著增加，辛酸甲酯和己酸正己酯的相对含量降幅较大，而AY中辛酸甲酯的相对含量降幅较大，而其长链脂肪酸乙酯的相对含量增幅较大。此外AL中4-乙基愈创木酚的相对含量大幅提高，且整个发酵过程中也单调增加，需进一步探究其原因。

参考文献

［1］ 赵梅，冷云伟，唐胜柏，等.芳香性微生物在酱油中的应用［J］.中国调味品，2009，34(6):64－67.

［2］ 赵德安.酱油传统酿造工艺与提高产品质量的探讨［J］.中国调味品，2009，34(8):22 －28.

［3］ 李幼筠，周通.科学利用微生物推动中国酱油工艺大变革［J］.中国酿造，2011(1):1－5.

［4］ van der Sluis C，Tramper J，Wijffels R H.Enhancing and accelerating flavor formation by salt-tolerant yeasts in Japanese soy-sauce processes［J］.Trends in Food Science ＆Technology，2001，12(9):322－327.

［5］ Akolkar A，Durai D，Desai A.Halobacterium sp.SP1(1)as a starter culture for accelerating fish sauce fermentation［J］，Journal of Applied Microbiology，2010，109(1):44－53.

［6］ Yan P M，Xue W T，Tan S S，et al.Effect of inoculating lactic acid bacteria starter cultures on the nitrite concentration of fermenting Chinese paocai ［J］，Food Control，2008，19(1):50－55.

［7］ 包启安.酱油科学与酿造技术［M］.北京:中国轻工业出版社，2011:299－306.

［8］ Gao X L，Cui C，Zhao H F，et al.Changes in volatile aroma compounds of traditional Chinese-type soy sauce during moromi fermentation and heat treatment［J］.Food Science and Biotechnology，2010，19(4):889－898.

［9］ Sun S Y，Jiang W G，Zhao Y P.Profile of volatile com-pounds in 12 Chinese soy sauces produced by a high-saltdiluted state fermentation［J］.Journal of the Institute of Brewing，2010，116(3):316－328.

［10］ 张艳芳，陶文沂.两种发酵酱油风味物质的分析研究［J］.精细化工，2008，25(5):486 －490.

［11］ Yasuhiko S，Motofumi S.Bioconversion of ferulic acid to 4-Vinyguaiacol and 4-ethylguaiacol and of 4-Vinyguaiacol to ethylguaiacol by halotolerant yeasts belonging to the genus Candida［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2007，71(4):1 058－1 062.

［12］ 高献礼，赵谋明，崔春，等.高盐稀态酱油挥发性风味物质的分离与鉴定［J］.华南理工大学学报，2009，37(10):117－122.

［13］ 马永昆，周珊，陈技峦，等.用SPME方法分析不同成熟度哈密瓜香气的研究［J］.食品科学，2004，25(7):136－139.

［14］ Gin A，Osako K，Okanoto A，et al.Effect of meat washing on the development of impact odorants in fish miso prepared from spotted mackerel［J］.Journal of the Science of Food Agriculture，2011，91(5):850－859.

［15］ Curioni P M G，Bosset J O.Key odorants in various cheese types as determined by gas chromatography-olfactometry ［J］.International Dairy Journal，2002，12(12):959－984.

［16］ 宋慧丽，韩舜愈，蒋玉梅，等.河西走廊地区赤霞珠干红葡萄酒中的香气成分分析［J］.食品科学，2009，30(10):257－260.