缬氨酸转氨酶拆分DL-缬氨酸的催化条件*

张飞，魏涛，刘寅，韩亚伟，何培新

(郑州轻工业学院，食品与生物工程学院，河南郑州，450002)

D-氨基酸作为重要的中间体，在食品添加剂、医药和农药等行业应用，广泛市场需求较大，已逐渐成为氨基酸行业新的发展方向［1－3］。D-丙氨酸作为原料可用于合成甜味剂阿力甜，也可用于合成农药精甲霜灵［4－5］。D-缬氨酸作为重要的中间体可用于合成高效杀虫剂氟胺氰菊酯［6－7］。

转氨酶在合成某些氨基酸及其衍生物领域具有一定应用价值。目前，关于转氨酶的研究报道较多的是该酶的酶学性质、催化机制及抑制动力学研究［8－10］。大肠杆菌缬氨酸转氨酶可以催化L-缬氨酸与丙酮酸反应生成α-酮异戊酸和L-丙氨酸。理论上，利用该酶可以把缬氨酸外消旋混合物中的L-缬氨酸转化为α-酮异戊酸，从而实现外消旋缬氨酸的拆分。目前，关于缬氨酸转氨酶在氨基酸手性拆分领域的应用报道甚少。本研究利用具有缬氨酸转氨酶活性的工程菌，初步考察了反应温度、pH、底物摩尔比、底物浓度和对拆分反应的影响，进而确定酶促反应的最佳条件。研究结果显示缬氨酸转氨酶具有一定应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

缬氨酸转氨酶基因工程菌(pET-32a-avtA)由本实验室构建。蛋白胨、酵母浸膏、丙酮酸均购自国药集团化学试剂有限公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，纯度≥98%，购自南京基天生物科技有限公司;戊二醛(25%)，天津市津宇精细化工厂;L-缬氨酸，分析纯，湖北新生源生物工程股份有限公司;DL-缬氨酸，纯度≥99%，由本实验室制备;茚三酮，分析纯，上海化学试剂站中心化工厂;其他试剂均为分析纯。LB液体培养基组成(1 L体系):蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，定容前用NaOH调节pH至7.0，120℃高压灭菌备用。

THZ-C恒温振荡器(太仓博莱特实验仪器厂);日立UV-3000型分光光度计(日本Hitachi公司);日立CR22E型离心机(日本Hitachi公司);自动旋光仪WZZ-2A;P2S电子天平(上海恒平科学仪器有限公司);RE2002旋转蒸发仪(上海予华仪器有限公司)。

1.2 菌种培养条件

上述缬氨酸转氨酶基因工程菌平板挑单克隆接种于10 mL含氨苄青霉素50 μg/mL的LB液体培养基，37℃恒温振荡培养过夜。次日，过夜培养物接种于2 L含氨苄青霉素50 μg/mL的LB液体培养基，37℃恒温振荡(180 r/min)培养6 h，使菌液600 nm光密度大约至0.5。然后冷却至30℃，加入终浓度为0.4 mmol/L IPTG，在30℃诱导8～10 h。最后离心收集细胞(5 000 r/min，4℃，15 min)。

1.3 菌体酶活力测定

称取0.1 g菌体置于100 mL三角瓶中，加入终浓度为0.2 mol/L DL-缬氨酸和0.1 mol/L丙酮酸溶液10 mL，加入 10% 土温-80 50 μL，调节 pH=7，于37℃搅拌反应20 min，离心除菌体，收集上清液煮沸5 min灭酶活，冷却。在以上条件下，缬氨酸转氨酶酶单位定义为每1 min每生成1 μmol的 L-丙氨酸所用的细胞量。

1.4 底物摩尔比对转化率的影响

DL-缬氨酸浓度固定为0.2 mol/L，另一底物丙酮酸浓度分别为 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mol/L，即L-缬氨酸与丙酮酸的摩尔比分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶10 和 1∶12。反应体积 20 mL，菌体用量 0.2 g，调节pH值至9，于45℃下搅拌反应18 h。然后取样测定样品中L-丙氨酸含量。转化率定义为:

1.5 底物浓度对转化率的影响

DL-缬氨酸终浓度分别为 0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mol/L，丙酮酸终浓度分别为 0.8、2.4、4.0、5.6、7.2 mol/L，即L-缬氨酸与丙酮酸摩尔比为1∶8。反应体积30 mL，菌体用量0.6 g，调节pH值至9，于45℃下搅拌反应48 h。然后取样测定L-丙氨酸含量。

1.6 金属离子对酶活的影响

在反应体系中分别加入终浓度为0.5 mmol/L的Cu2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+、Na+，测定酶活力，以不加金属离子作为对照。

1.7 丙氨酸含量测定

反向高效液相色谱(RP-HPLC)测定样品中L-丙氨酸的浓度，所用色谱柱为Cosmosil 5C18-AR，20 mm i.d.×250 mm，5 μm流动相为0.06%TFA水溶液-乙腈(体积比为98∶2)，流速为1.0 mL/min，进样量为 10 μL。

2 结果与分析

2.1 温度对酶活的影响

温度对酶活力的影响见如图1。缬氨酸转氨酶在45℃时酶活达到最大值，可以看出在一定范围内，随着温度升高，酶活性逐渐增大;相对酶活达到最大值后，随着温度的进一步升高，酶活反而减小。

图1 温度对酶活力的影响Fig.1 Effect of temperature on enzyme activity

2.2 pH值对酶活的影响

酶活随pH值的变化规律如图2所示。在一定pH值范围内，酶活随着pH值的升高而相应的升高;当酶活性升高到最大值后随着pH值的进一步升高，酶活性开始降低;菌体的最适pH在pH=9附近。从实验结果还可以看出，该酶的最适pH值比生物体内天然pH值高，其原因是转氨反应属于加成反应，其反应机理是由供体氨基氮原子的孤对电子进攻受体酮酸羰基碳原子，在酶的作用下，形成反应中间体，然后生成产物。较高的pH值可以使供体氨基氮原子更多处于自由态，而不是结合H+离子，这样更有利于氮原子进攻羰基碳原子发生化学反应。

图2 pH对酶活力的影响Fig.2 Effect of pH on enzyme activity

2.3 底物摩尔比对转化率的影响

在酶催化的多底物生化反应中，增加其中一种底物的相对浓度常常可以促进另一种底物的转化。从图3可以看出，随着底物L-缬氨酸与丙酮酸的摩尔比逐渐增大，转化率也同时增大;当底物L-缬氨酸与丙酮酸的摩尔比增加到1∶8时，转化率达到最大值98.7%;之后，随着摩尔比的进一步增加，转化率趋于稳定。因此，选择L-缬氨酸与丙酮酸摩尔比1∶8为最佳底物比例。

图3 底物摩尔比对转化率的影响Fig.3 Effect of substrate mole ratio on enzyme activity

2.4 底物浓度对转化率的影响

从图4可以看出，随着底物浓度的增加转化率有降低的趋势。当L-缬氨酸底物浓度为0.1 mol/L和0.3 mol/L时，转化率最分别是98.6%和98.3%;当L-缬氨酸浓度进一步升高时，转化率明显降低。高底物浓度条件下转化率降低的原因可能是高浓度产物对催化反应的抑制。因此，为了充分发挥酶的催化效率，实际应用中以DL-缬氨酸为0.6 mol/L和丙酮酸浓度为2.4 mol/L作为最适底物浓度。

图4 底物浓度对转化率的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on enzyme activity

2.5 金属离子对酶活的影响

金属离子可以影响酶解底物络合物的形成，以及改变和影响酶的催化活性。从图5可以看出，金属离子对缬氨酸转氨酶活性影响比较明显，Cu2+、Co2+、Fe2+、Mn2+对酶活性有抑制作用，而 Mg2+、Na+对酶活性有一定的激活作用。

图5 金属离子对酶活的影响Fig.5 Effect of metal ion on enzyme activity

3 结论

目前制备D-氨基酸的方法主要有生物酶法、不对称化学合成法和光学拆分法［11］。不对称合成法需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂，该法成本高不适合大规模制备。光学拆分法(或非对映体盐法)需要筛选合适的化学拆分剂，该法应用领域有限也不适合大量制备。生物酶法制备D-氨基酸由于具有经济、高效、环保等优点逐渐成为国内外研究热点［12］。本研究利用大肠杆菌缬氨酸转氨酶把缬氨酸外消旋混合物中的L-缬氨酸转化为α-酮异戊酸，从而实现外消旋缬氨酸的拆分。实验中考察了反应温度、pH值、底物摩尔比、底物浓度和金属离子对拆分反应的影响，进而确定酶促反应的最佳条件。结果表明，该催化反应的最适反应条件为:反应温度是45℃，pH=9，L-缬氨酸与丙酮酸的摩尔比 1∶8，DL-缬氨酸初始浓度为0.6 mol/L和丙酮酸初始浓度为2.4 mol/L，0.5 mmol/L的Mg2+和Na+对酶活性有明显的促进作用。本实验结果对于转氨酶的进一步开发应用有参考价值。

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