实时荧光定量PCR监测镇江香醋醋酸发酵过程中微生物变化*

陶京兰，陆震鸣，4，王宗敏，李国权，史劲松，2，许正宏，2，4

1(江南大学药学院，江苏无锡，214122)2(国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州，646000)3(江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏镇江，214043)4(中国科学院天津工业生物技术研究所天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，天津，300308)

食醋是深受我国人民喜爱的一种酸性调味品。经过数千年的发展，食醋的生产遍及全国各地，其中以山西陈醋、镇江香醋、四川保宁醋、福建永春老醋等最具代表［1－2］。中国食醋的酿造采用典型的多菌种混合发酵工艺，通过多种微生物的代谢作用产生风味饱满、酸味柔和的食醋。食醋的发酵过程主要分为酒精发酵和醋酸发酵两个阶段。在酒精发酵阶段，谷物原料如糯米、高粱等经过霉菌和酵母菌的一系列代谢，最终生成酒精;而醋酸发酵阶段则是由多种细菌和真菌共同参与，将酒精转化为醋酸的过程［3］，是决定食醋风味和品质的关键步骤［4－5］。前期研究表明，醋酸菌、乳酸菌和酵母是醋酸发酵过程的优势功能微生物，在整个微生物群落中占到 80% 以上［6－8］，因此，监测发酵过程中醋酸菌、乳酸菌和酵母的生物量变化对于食醋发酵过程的控制以及提高产品的风味具有重要的生产意义。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性的探针，利用荧光信号累积对PCR产物进行标记跟踪，实时监测整个PCR进程，最后结合相应的软件通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法［9］。该技术已经被成功用于复杂微生物群落中微生物的定量分析，如Persson等应用RT-qPCR特异性鉴定了都伯林沙门菌，并将其应用于食品质量控制［10］。在传统发酵食醋的酿造微生物研究方面，已有学者采用微生物纯培养技术、PCR-DGGE和克隆文库分析技术等对食醋发酵过程中微生物群落的结构进行了解析［11－13］，但是微生物的定量数据报道较少。本研究采用RT-qPCR技术对镇江香醋醋酸发酵阶段的醋醅中总细菌、总真菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母进行了定量分析，相关研究结果将为食醋酿造机理解析、发酵工艺过程控制奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

醋酸发酵过程的醋醅样品取样于江苏恒顺醋业股份有限公司，每天取样1次。

RNaseA、蛋白酶K、琼脂糖、Lysozyme溶菌酶，生工生物工程(上海)股份有限公司;HCl、EDTA、Na3PO4、CTAB、NaCl、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇，国药集团股份有限公司;PCR试剂(Takara ExTaq、dNTP等)，EASY Dilution宝生物工程 (大连)有限公司;Ssofast Eva Green预混液、低位96孔无裙边PCR反应板、96孔板黏性光学级封膜，美国BIORAD公司。

DNA 提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA钠盐，100 mmol/L磷酸三钠，1.5 mol/L NaCl，1%CTAB ，pH 8.0。

TE 溶液:TE Buffer为 10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

1.2 实验仪器

C1000 Thermal Cycler、CFX96实时定量PCR仪、核酸电泳仪，美国BIO-RAD公司;DyNA Quant 200核酸浓度测定仪，美国PHARMACIA BIOTECH公司;GDS凝胶成像系统，英国UVP公司;制冰机，日本SANYO公司;真空干燥仪，美国SAVANT公司。

1.3 醋醅总DNA的提取

醋醅总DNA提取采用改良的CTAB法。称取2 g醋醅，用液氮充分研磨3～4次;向研磨的粉末中加入13.5 mL DNA提取缓冲液和100 μL蛋白酶K，37℃，225 r/min水平振荡30 min;加入3 mL 10%SDS溶液和200 μL 50 mg/mL溶菌酶，65℃水浴2 h(中间颠倒混匀数次);室温离心(6 000×g，10 min)，并收集上清液到50 mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)摇匀，4℃离心(6 000 × g，7 min)，收集上清液;加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1 h;离心收集沉淀(16 000×g，20 min);用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，洗涤、离心(10 000×g，10 min)、干燥;加入 100 μL TE溶液和终浓度为 0.5 mg/mL RNaseA，37℃水浴2 h;－20℃保存。

提取的DNA样品适当稀释后采用核酸浓度测定仪确定DNA浓度，分析A260/A280评价DNA纯度，采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的降解程度和RNA消化情况。

1.4 RT-qPCR特异性引物设计

针对醋醅中总细菌、总真菌、醋酸菌、乳酸菌和酵母分别设计特异性引物(表 1)［3，14］，用于 RT-qPCR扩增。

表1 微生物特异性引物的名称及序列Table 1 Names and sequences of specific primers

1.5 醋醅微生物的RT-qPCR定量分析

RT-qPCR反应体系:Ssofast Eva Green Mix 10 μL，引物各 1.0 μL，模板 10 ng，加 ddH2O 至 20 μL。

RT-qPCR反应程序:95℃ 10 s;95℃ 5 s，最佳退火温度(表1)10 s，40个循环。然后体系从65℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，每次维持0.05 s，绘制熔解曲线。

微生物的定量采用绝对定量法，即采用已知浓度的标准品制作标准曲线，对未知浓度的样品进行其拷贝数的测定。标准品为含有目的片段的单拷贝克隆质粒［15］。标准品浓度计算:

其中:c标，标准品浓度(copies/μL);OD260nm，由核酸浓度测定仪3次测定的平均值;A，换算系数0.05，即1 OD260nm=0.05 μg/(μL dsDNA);N，稀释倍数;6.02×1023，阿佛加德罗常数。

对标准品进行10倍梯度稀释，然后以标准品为模板进行RT-qPCR反应。反应完成时，以阈值循环数Ct(即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)作为横坐标，标准品浓度的对数作为纵坐标绘制标准曲线。

以醋酸发酵过程中不同时间的醋醅样品总DNA为模板，进行RT-qPCR特异性扩增，并根据标准曲线计算醋醅中各类微生物的拷贝数。

2 结果与分析

2.1 醋醅样品总DNA的提取分析

采用改良的CTAB法提取醋醅样品总DNA，琼脂糖凝胶电泳验证结果(图1)，核酸浓度测定仪测定其浓度(表2)，可知DNA电泳条带都较整齐、清晰，均无明显拖尾现象，表明总DNA完整且无明显降解;A260/A280比值在1.8左右，总DNA质量较高，可用于RT-qPCR分析。

图1 醋醅样品总DNAFig.1 Total DNA of the vinegar fermentation culture M:λ-Hind III digest DNA Marker，1－19:total DNA of the vinegar fermentation culture samples

表2 醋醅样品总DNA的A260/A280比值Table 2 A260/A280of total DNA of the vinegar fermentation culture

2.2 RT-qPCR反应的标准曲线及熔解曲线

本实验中各类微生物的RT-qPCR扩增曲线为典型的倒S曲线，基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围较宽。总细菌、总真菌、醋酸菌、乳酸菌、酵母的反应标准曲线及熔解曲线如图2所示。熔解曲线呈现单一熔解峰，说明无引物二聚体及非特异性产物;曲线平稳，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好。标准曲线线性较好(R2=0.992 4～0.997 7)，标准品浓度范围分别为:总细菌1.96×1012～1.96×103;总真菌6.18×1012～6.18×103;醋酸菌1.94×1012～1.94×103;乳酸菌6.92×1012～6.92×103;酵母菌8.18×1010～8.18 ×101。

2.3 醋酸发酵阶段微生物生物量的动态变化

醋酸发酵阶段各类微生物生物量的变化如图3所示。发酵起始阶段(1～7天)，醋醅中总细菌、醋酸菌和乳酸菌的生物量快速上升，分别于第6、7、4天达到最大拷贝数，为4.85×1011，1.14×1010和3.37×1011copies/g干醅。随后各类细菌的生物量逐渐下降，并维持在一定数量级(108～109)。醋醅中总真菌、酵母的生物量在发酵前期(1～7 d)变化不大，并维持在一定水平(107～1010)。总真菌的生物量在第7天后逐渐下降，由发酵起始的1.20×1010copies/g干醅下降为发酵结束时的7.59×104copies/g干醅，而酵母的生物量则在发酵8～12 d内下降为0。

由结果可知，醋酸菌和乳酸菌占醋醅中细菌总量的80%以上，是酿醋主体功能性微生物，两者可利用酒精生成乙酸和乳酸等构成食醋主体风味的有机酸。另外，镇江香醋采用分层翻醅的独特酿造工艺，在发酵起始阶段，醋醅的中、下层由于未翻醅而形成厌氧或痕量氧的环境，适合乳酸菌等兼性厌氧微生物快速繁殖，于第4天达到最大生物量，而醋酸菌等好氧微生物则在第7天达到最大生物量。醋酸发酵阶段醋醅中的酵母主要来自于酒精发酵阶段的酒醪，其具有发达的酶系，可在醋酸发酵过程中起到降解底物以及催化醋酸发酵时生成的有机酸与酒精发酵阶段生成的醇类生成众多酯类等风味物质。发酵第8天后酵母的生物量快速下降，可能是由于酸性环境的抑制作用所致。

3 结论

RT-qPCR具有速度快、特异性强、灵敏度高、交叉污染少、自动化程度高、全封闭反应以及定量准确等特点，目前已被广泛应用于食品、医药和环境等研究领域。本文通过RT-qPCR的定量分析，证实了醋酸菌、乳酸菌和酵母为醋醅中的主体微生物，三者占细菌和真菌总和的80%以上。醋酸发酵阶段醋醅中总细菌、醋酸菌和乳酸菌的生物量均呈现先上升后下降至一定水平的变化趋势。其中，醋酸菌和乳酸菌的生物量分别在第7天和第4天达到最大拷贝数，为细菌中主要微生物。总真菌和酵母在发酵起始阶段变化不大，总真菌的生物量在第7天后逐渐下降，而酵母的生物量则在发酵8～12 d内下降为0。醋酸菌、乳酸菌和酵母作为醋酸发酵过程中的主要微生物，其功能有待进一步研究。

图2 标准曲线及熔解曲线Fig.2 Standard curve and melting curve of the microorganism

图3 醋酸发酵过程中微生物动态变化曲线Fig.3 Dynamic curve of the microorganism during the fermentation process

［1］ Liu Deng-ru，Zhu Yang，Beeftink R，et al.Chinese vinegar and its solid-state fermentation process［J］.Food Reviews International，2004，20(4):407 －424.

［2］ 萧凤岐.食醋的历史与文化［J］.中国酿造，2000(4):31－33.

［3］ Xu Wei，Huang Zhi-yong，Zhang Xiao-jun，et al.Monitoring the microbial community during solid-state acetic acid fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar［J］.Food Microbiology，2011，28(6):1 175－1 181.

［4］ Tesfaye W，Morales M L，Garcia-Parrilla M C，et al.Wine vinegar:technology，authenticity and quality evaluation［J］.Trends in Food Science and Technology，2002，13(1):12－21.

［5］ 张丽娟，许伟，许泓瑜，等.恒顺香醋固态发酵过程中有机酸的变化分析［J］.中国调味品，2009，34(2):106－109.

［6］ 许伟.镇江香醋醋酸发酵过程微生物群落及其功能分析［D］.无锡:江南大学博士论文，2011.

［7］ 颜景宗，颜丹.山西传统山西老陈醋酿造工艺技术［J］.中国酿造，2004(7):30－32.

［8］ Wu Jia-jia，Ma Ying-kun，Zhang Fen-fen，et al.Biodiversity of yeasts，lactic acid bacteria and acetic acid bacteria in the fermentation of“Shanxi aged vinegar”，a traditional Chinese vinegar［J］.Food Microbiology，2012，30(1):289－297.

［9］ 赵文静，李妍，高鹏飞，等.实时荧光定量PCR技术在乳酸菌定量检测中的应用［J］.食品与生物技术学报，2009，28(4):433－437.

［10］ Persson S，Jacobsen T，Olsen J E，et al.A new real-time PCR method for the identification of Salmonella dublin［J］.Journal of Applied Microbiology，2012，113(3):615－621.

［11］ Haruta S，Ueno S，Egawa I，et al.Succession of bacterial and fungal communities during a traditional pot fermentation of rice vinegar assessed by PCR-mediated denaturing gradient gel electrophoresis［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，109(1/2):79－87.

［12］ 许伟，张晓君，李琦，等.微生物分子生态学技术在传统发酵食品行业中的应用研究进展［J］.食品科学，2007，28(12):521－525.

［13］ Li Xiao-ran，Ma En-bo，Yan Liang-zhen，et al.Bacterial and fungal diversity in the traditional Chinese liquor fermentation process［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，146(1):31－37.

［14］ Sanz A，Martin R，Mayoral M B，et al.Development of a PCR-culture technique for rapid detection of yeast species in vacuum packed ham［J］.Meat Science，2005，71(2):230－237.

［15］ Lee C L，Ow D S W，Oh S K W.Quantitative real-time polymerase chain reaction for determination of plasmid copy number in bacteria［J］.Journal of Microbiological Methods，2006，65(2):258－ 267.