人胃癌细胞原位移植转移裸鼠原发灶及转移灶中锌指蛋白139的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系研究

赵 群，李 勇，范立侨，檀碧波，侯五辉，李兆星，王 冬，刘 羽

侵袭转移是胃癌演进过程中多步骤、多因素参与的复杂过程，也是造成胃癌患者预后差的最主要原因［1-2］。侵袭转移与多种基因有关，锌指蛋白 (ZNF)家族成员对多种基因的转录调控发挥着重要作用［3-4］。笔者前期研究发现，锌指蛋白139(ZNF139)作为ZNF家族中的一员，与胃癌细胞分化程度密切相关［5］。目前，关于ZNF139在胃癌细胞侵袭转移中作用机制的研究报道较少，研究胃癌侵袭转移的体内模型对于模拟胃癌转移过程也还不令人满意。因此，本研究通过建立人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型模拟胃癌在体内的转移过程，检测ZNF139在胃癌原发灶及转移组织中的表达，同时检测与胃癌细胞侵袭转移能力直接相关的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)的表达，并对其关系进行分析，旨在对胃癌侵袭转移的调控机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料 兔抗人ZNF139单克隆抗体为美国Sigma公司产品，鼠抗人MMP-2、MMP-7单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，Trizol Reagent、引物均购自美国 Invitrogen公司，cDNA合成试剂盒为美国Fermentas公司生产，免疫组织化学S-P染色试剂盒、二氨基联苯胺 (DAB)显色剂购自北京中杉金桥生物有限公司，人胃癌细胞株SGC7901购自中科院上海细胞所。实验动物:4周龄BALB/C雄性裸鼠44只，体质量18～25 g，平均 (22.4±4.4)g，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号:0221950。

1.2 细胞培养 人胃癌细胞株SGC7901常规进行细胞复苏、传代，调节细胞浓度，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 裸鼠饲养 裸鼠在河北医科大学第四医院动物中心无特定病原体 (SPF)条件下的动物实验室进行分笼标准饲料喂养，其中14只裸鼠用于皮下移植瘤鼠间传代，30只用于建立原位移植转移模型。

1.4 人胃癌细胞株SGC7901裸鼠移植瘤的建立

1.4.1 皮下移植瘤模型建立 取细胞浓度至少为3.5×105个/ml的细胞悬液0.2 ml，注射于2只裸鼠背部，接种约3周后瘤体生长至直径约1 cm时剥取瘤体，清除纤维包膜，浸泡在培养基内将其切成1 mm×1 mm×1 mm小组织块，切开其他未荷瘤裸鼠背部皮肤，将小组织块植入后缝合皮肤，饲养约3周后移植瘤生长至直径1 cm时再行取瘤接种，此过程反复6次，获得可在裸鼠体内稳定生长的胃癌细胞株SGC7901实体瘤组织块，开始进行原位移植。

1.4.2 原位移植瘤模型建立 皮下移植瘤裸鼠术前禁食12 h，腹腔注射0.6%戊巴比妥麻醉 (50 mg/kg)，常规消毒皮肤后铺巾，取腹正中切口，于剑突下切开约1.5 cm皮肤，自白线处切开腹膜进腹，将鼠胃稍拉出腹腔，在鼠胃大弯侧血管丰富区划开胃浆膜层成一“十”字，观察到出血后将稳定传代6次的胃癌组织块接种于此。在此“十”字处滴少量OB胶，将网膜组织覆盖在胶上，待粘合牢固后将鼠胃还纳入腹，关腹。继续饲养，待裸鼠出现全身衰竭症状时处死。

1.5 组织标本制备 新鲜标本一式两份，一份置于-80℃环境准备行逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)检测;另一份浸泡在10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋后连续4 μm切片后进行苏木素-伊红染色 (HE染色)及免疫组织化学S-P染色。

1.6 RT-PCR检测目的基因mRNA表达 提取总RNA，RNA定量，逆转录，设置热循环参数，预变性94℃ 5 min，94℃变性30 s，72℃退火5 min，72℃延伸5 min，扩增30个循环，最后72℃延伸5 min，扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，采用数字凝胶成像分析吸光度，不同组织目的基因表达水平以检测值与甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)吸光度的比值表示，所用引物序列见表1。

表1 ZNF139、MMP-2、MMP-7基因引物序列Table 1 Primer sequence of ZNF139，MMP-2，MMP-7 genes

1.7 HE染色 二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，脱蜡，乙醇梯度脱水，清洗，苏木素染色5 min，清洗，1%盐酸乙醇30 s，氨水清洗后伊红染色2 min，乙醇梯度脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，透明，中性树胶封片。

1.8 免疫组织化学S-P法检测目的基因蛋白表达 按试剂盒说明对标本进行染色并由2名病理科医师盲法判断染色结果。以磷酸缓冲液 (PBS缓冲液)代替一抗作为阴性对照，结果为阴性。光镜下以胞质或胞膜或胞核中出现粗细一致的棕黄色颗粒为阳性染色，光镜 (×400)下随机观察5个视野，采取二次计分法:首先按染色强度计分:0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;再按阳性细胞率计分，阴性计0分，阳性细胞率≤10%计1分，11% ～50%计2分，51% ～75%计3分，＞75%计4分。染色强度得分和细胞阳性率得分的乘积≤2判断为阴性，＞2为阳性。

1.9 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以 (x±s)表示，采用t检验;计数资料采用McNemar's χ2检验;相关性分析采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型的建立 裸鼠接种4～5周后上腹部均触及较明显的肿块，逐渐消瘦，活动欠佳，最后出现弓背、肋骨突出、反应差等全身衰竭征象。荷瘤鼠生存期最短为78 d，2只处死前死亡，未能进行检测，成瘤率为93.3%(28/30)。解剖发现28只裸鼠原位移植瘤均在胃壁上生长成瘤，其中75.0%(21/28)发生肝转移，67.9%(19/28)发生脾转移，85.7% (24/28)发生腹膜种植转移，39.3%(11/28)发生淋巴结转移 (见图1)。

2.2 ZNF139、MMP-2、MMP-7 mRNA在不同组织的表达ZNF139、MMP-2、MMP-7 mRNA在肝转移灶、腹膜种植转移灶、转移淋巴结中的表达高于相应原发灶，差异均有统计学意义 (P＜0.001);而脾转移灶中ZNF139、MMP-2、MMP-7 mRNA的表达与原发灶比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见图2、表2)。

2.3 ZNF139、MMP-2、MMP-7在不同组织的表达ZNF139、MMP-2、MMP-7在肝转移灶、腹膜种植转移灶、转移淋巴结中的蛋白表达阳性率高于相应原发灶，差异均有统计学意义 (P＜0.05);而脾转移灶中 ZNF139、MMP-2、MMP-7蛋白表达阳性率与原发灶比较，差异均无统计学意义(P＞0.05，见表3)。

2.4 相关性分析 Spearman相关分析结果显示，人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型原发灶、肝转移灶、脾转移灶、腹膜种植转移灶及转移淋巴结中ZNF139 mRNA与MMP-2 mRNA、MMP-7 mRNA的表达均呈正相关 (P＜0.05，见表4)。

图1 人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型的建立Figure 1 Models of orthopotic implantation nude mice

表2人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型原发灶和各转移灶中ZNF139、MMP-2、MMP-7 mRNA的表达情况 (x±s)Table 2 Expressions of ZNF139，MMP-2，MMP-7 mRNA in primary tumors and metastases of orthotopic implantation nude mice

图2 人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型原发灶和各转移灶中ZNF139、MMP-2、MMP-7 mRNA的表达Figure 2 Expressions of ZNF139，MMP-2，MMP-7 mRNA in primary tumors and metastases of orthotopic implantation nude mice

表3 人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型原发灶和各转移灶中ZNF139、MRP-1、MMP-7的表达情况 (只)Table 3 Expressions of ZNF139，MMP-2，MMP-7 protein in primary tumors and metastases of orthotopic implantation nude mice

表4 人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型原发灶和各转移灶中ZNF139 mRNA与MMP-2 mRNA、MMP-7 mRNA表达的相关性Table 4 Correlation of ZNF139 mRNA，MMP-2 mRNA，MMP-7 mRNA in primary tumors and metastases of orthotopic implantation nude mice

3 讨论

动物模型是研究恶性肿瘤过程中非常重要的实验材料。侵袭转移是胃癌的主要进展方式，肿瘤转移动物模型对研究肿瘤进展的规律、寻找有效治疗措施意义重大。目前胃癌研究中最常用的动物模型仍然是皮下荷瘤动物模型［6-7］。这种动物模型制备方法简单，但很难真实反映胃癌的实际转移状态。因此，本研究应用组织块法建立了人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型并观察肿瘤侵袭转移情况;应用医用OB胶粘贴法将人胃癌组织块固定于裸鼠胃壁，本组30只荷瘤鼠中28只成瘤，成瘤效果满意，可很好地模拟胃癌在人体内的侵袭、转移过程。

研究表明，原发灶肿瘤细胞可通过多种途径转移、扩散，且在转移过程中肿瘤的侵袭能力也发生变化［8］。胃癌细胞浸润和转移首先需对其周边细胞外基质和基底膜降解，形成肿瘤细胞转移的通道，MMPs在此过程中起重要作用。MMP-2、MMP-7是MMPs家族的重要成员，在胃癌侵袭转移过程中起重要作用［9-10］。本研究结果发现，人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型肝转移灶、腹膜种植转移灶及转移淋巴结中MMP-2、MMP-7的mRNA表达水平和蛋白表达阳性率均高于原发灶，说明肿瘤细胞在转移过程中侵袭基因发生了改变，进而影响肿瘤细胞的侵袭能力，造成转移灶的肿瘤侵袭能力强于原发灶，加速肿瘤的进展和扩散。

在肿瘤侵袭转移的调控机制中，多种基因发挥了作用，ZNF家族成员与肿瘤的侵袭转移关系密切［11］。本研究结果显示，人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型肝转移灶、腹膜种植转移灶及转移淋巴结中ZNF139 mRNA表达水平和蛋白表达阳性率均高于原发灶，且 ZNF139 mRNA与 MMP-2 mRNA、MMP-7 mRNA的表达在各组织中均呈正相关，说明ZNF139可能通过调控MMP-2、MMP-7的表达而参与胃癌细胞的侵袭转移，并在侵袭转移过程中其表达能力进一步增强。值得注意的是，脾转移灶中ZNF139、MMP-2、MMP-7 mRNA表达水平和蛋白表达阳性率与原发灶比较，均未见明显差异，这可能与脾作为免疫器官的特性有关，其具体作用机制有待进一步深入研究。

总之，本研究成功建立了人胃癌细胞原位移植转移裸鼠模型，发现与原发灶比较，转移灶中肿瘤细胞具有更强的侵袭能力，ZNF139可能通过调控MMP-2、MMP-7的表达而参与肿瘤侵袭转移过程，但其具体作用机制还有待进一步研究。

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