烟草早花机理研究进展

杨静 陈杰 郭鸿雁 陈建军 贺广生 邓世媛 王维

（1.华南农业大学农学院，广州 510642；2.广东烟草韶关市有限公司，韶关 512000）

烟草早花指烟草植株未能达到正常生长应具有的高度和叶数就现蕾开花。发生早花的烟株，过早地从营养生长转入生殖生长，导致生长势弱，叶数减少，叶片窄小，叶片的产量和质量降低［1，2]。国内外烟叶生产均存在烟草早花问题［3，4]，严重影响着烟叶的生产。研究烟草早花问题需要了解植物开花机理，近百年来，人们在开花生理生化方面进行了大量的探索，提出了光周期理论、开花素学说、养分分配假说，并对光周期诱导、温度影响等因素进行了大量研究。在进入20世纪70年代之后植物发育研究陷入低谷［5]，直到1990年，Yanofsky等［6]成功地分离了花器官发育控制基因AGAMOUS，从此打破了植物发育生物学研究的沉寂，植物发育生物学的机理研究由以生理生化为主转变到以分子生物学及生理遗传学为主。目前有关植物开花的研究，国内多集中在品种、温度和光照三个方面［7]，侧重于生理生化并且缺乏系统全面的研究；国外的研究则比较详尽，且已由生理机理的研究深入到分子机理的研究。对烟草而言，由于种植区域广、栽培品种多、栽培过程相对繁琐且各地不一致，造成烟草早花的原因错综复杂，烟草早花的研究至今仍未能建立一个统一的理论体系。分子生物学的发展促进了烟草成花基因的研究，也使得对烟草早花的研究更为深入和系统。总的来说，烟草成花机理十分复杂，烟草是如何获得信号、何时进入花的发生和发育阶段仍有待进一步研究，烟草成花的分子机理研究将推动烟草早花研究的进一步发展［8]。

1 烟草成花的生理与分子机理

1.1 烟草的成花决定

植物开花需要建立在成花决定态之上［9]。成花决定态指细胞具有分化为花的能力但还未开始花的分化时所处的状态。当成花决定态细胞达到一定数量时就可以启动花的发生，开始花的发育［10]。有观点认为，在正常生长条件下 ，发育的遗传特性有着决定性影响，烟草在形成花芽之前必须分化出可预测的节和节间数。另一种观点认为：烟草的整个生育期按营养生长期至生殖生长期的顺序逐步完成［11]。李文安等［12]通过培养黄花烟草（N.rustica）叶肉原生质体表明，从愈伤组织可直接产生正常的花与花蕾，而不需要先形成茎与叶片，且不同光周期处理对花芽的形成没有影响。另外，他们在利用烟草不同发育时期，植株上不同部位的薄层组织配合一定的培养基进行组织培养的试验中发现，营养生长时期主茎薄层组织无花芽分化能力，随着植株生长发育进入现蕾期、主茎薄层从花序顶端向下逐步出现花芽分化能力，在形成花芽的盛期时，几乎主茎的所有节位均有形成花芽分化能力，植株在开花盛期时，主茎表皮薄层形成花芽的能力，由下部节位向上部节位开始逐渐减弱，至青果期主茎表皮薄层已完全失去分化花芽的能力，只有营养芽出现，花序区内的主茎已无分化花芽的能力。而花序枝梗，小枝梗却表现出强有力的花芽分化现象［13]。综上各种观点及结果表明，细胞需要达到一定的状态才能感受外界刺激，进行花芽分化，但如何界定这个状态至今仍未有明确统一的判断标准。

1.2 调控开花的主要基因

拟南芥是所有植物中开花基因人们研究得最为透彻的一种植物，现已深入到各途径各基因的分子机理研究，在拟南芥上的一系列研究结果表明，开花主要是体内抑制状态在环境因子或体内发育信号的诱导下逐步解除的过程，解除方式可通过多种途径进行。通常将拟南芥的开花归结为4条主要途径［16]：光周期途径、春化作用途径、赤霉素途径和自主途径，与开花时间相关的基因通过这四条途径共同调控花分生组织特征基因的表达从而促使植物开花。调控过程，如图1所示。

光周期途径的主要调控基因是CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUS T（FT）、LEAFY（LFY）和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（SOC1）。经过光刺激和生物节律调控之后，CO诱导其下游的基因FT、LFY（LEAFY）和SOC1，从而促进植物开花，其中最为主要的基因有FT、SOC1和LFY，它们整合了各途径对开花时间的影响［17-19]。春化作用途径中的主要调控基因有：FRIGIDA（FRI）、FLOWERING LOCUS C（FLC）、VERNALIZATION 1（VRN1）、VERNALIZATION 2（VRN2）和VERNALIZATION INSENSITIVE3（VIN3）。FRI能促进FLC的表达，抑制开花［20，21]。FLC能直接抑制FT与SOC1的表达，从而造成植物晚开花［22]。而自主途径与春化作用途径都能通过抑制FLC基因的表达来促进开花［23]。FT蛋白被认为是一直在寻找的成花素，近年来的研究表明FT蛋白需要在FD的配合下整合调控茎尖端花芽分化［24]。大量研究表明，FT同源基因在拟南芥、水稻、柑橘、番茄、白杨、牵牛花、梨、向日葵和葫芦中的过量表达都能促进开花，预测了FT基因具有促进开花的保守功能［25]。

表1 拟南芥中与开花相关的基因

拟南芥开花基因的研究开启了植物开花基因研究的大门，在对拟南芥开花基因研究的基础上，通过对拟南芥开花基因同源基因的搜寻，水稻、谷物、果树中与开花相关的基因的研究也已取得了很大的进展，与开花相关的基因相继被克隆［26，27]。

目前对烟草中存在的与开花时间相关基因的研究比较少。Kelly等［37]从烟草中克隆了FLORICAULA（FLO）和LFY的同源基因NFL1和NFL2（Nicotiana FLO/LFY），但试验证明它们与植株开花并无直接关系。Smykal等［38]从烟草中克隆了与开花时间相关的基因Nicotiana SOC1（NtSOC1）和NicotianaFUL（NtFUL），并经过试验表明它们与光周期特性有关，其过表达能引起烟草提早开花。王小彦等［39]通过低温等处理烟草后，分析了低温诱导烟草早花中的SOC1以及一些与代谢相关的酶、部分植物生长物质的基因表达变化。李元元［40]根据不同植物MADS-box家族基因的保守区序列，设计简并引物，从烤烟品种NC82中克隆出了MADS-box家族的同源基因。

表2 其他作物中与拟南芥开花基因具有同源性的基因

1.3 影响开花的生理信号物质

调控植物开花的生理信号物质多种多样，但其作用机制仍有待进一步研究。傅永福等［41]研究归纳了多种成花生理信号物质，这些信号物质可分为促进型和抑制型，同一信号物质在不同植物的成花诱导过程中，或起促进作用，或起抑制作用，或二者兼而有之，这取决于植物的特性、信号物质的浓度及其状态（自由态或束缚态），不同植物或同一植物不同发育时期对同一物质的敏感性不同。Eriksson等［42]通过研究赤霉素促进开花基因的表达证明，在没有受到温度和光照诱导的条件下，拟南芥可以通过自身合成的赤霉素促进开花。Martinez等［43]通过研究开花基因表达量的变化，证明水杨酸能调节植物开花，缺乏水杨酸能导致植物晚开花，并且水杨酸在光周期途径与自主途径中有一定的调节作用，但不影响与开花时间相关的基因的表达。上述研究表明，不同的生理信号物质对成花的影响程度、调控方式存在差异，有的物质能够直接影响与开花时间相关的基因的表达，有的则通过影响其他生理机能间接调控开花。成花信号物质种类繁多且机理复杂，各种成花信号物质是怎样调控植物开花时间的仍有待更深入的研究且与分子技术相结合。

2 影响烟草开花的环境因素

2.1 光照

光对植物开花的影响包括光周期的影响、光质的影响和光照强度的影响。人们对烟草光周期特性进行了大量的研究，但由于品种、区域、试验方法各不相同，不同人的试验结果不同，对同一品种，由于地区和试验方法差异，说法也存在差异。曹显祖等［44]研究认为，烤烟品种K326为日中性。颜合洪等［45]通过试验表明K326对光周期的反应具有短日性，经短日照处理后，烟株现蕾明显提前。在影响开花时间的因素中，光周期起着重要的调控作用。研究认为，蓝光和远红光比红光更易促进植物开花［46]。Eskins［47]的研究显示，蓝光能促进拟南芥提早开花，红光则不能。魏胜林等［48]研究显示，蓝光下培育的菊花花期可提前12 d，红光处理提前6 d，蓝光促进花芽分化和开花比红光效果明显。肖金香等［49]通过在烟株旺长后期覆盖遮阳网研究表示，烟株生长中后期降低光照强度会使烤烟现蕾、开花期推迟。而生产上烟草移栽季节遇低温阴雨天气易早花有可能是因为光照不足所引起。光对烟草各个时期的影响如何值得研究和探讨，各品种烟草的光周期性，尤其是各地区主栽烤烟品种的光周期特性仍需进行针对性的研究，只有针对各地、各品种进行具体试验，才能有效指导生产。

2.2 温度

有关温度对烟草开花的影响，大多数研究认为低温对烟草早花具有诱导和促进作用［50]。韩锦峰等［51]以K326为材料，研究了低温对烟株顶芽发育及顶芽内激素含量的影响，结果表明到第6片真叶时，K326才对低温敏感，且低温诱导只有持续到7叶时才能有效。金磊等［52]对低温诱导后烤烟茎端分生组织的花芽分化过程的研究则发现，在相同时间的苗期低温逆境下，其他品种可提前开花以保持生育周期正常完成，而K326没有早花，但整个生育周期都会受到不良影响。这与陈卫国等［53]的烤烟品种耐寒性研究结果一致。不过也有试验结果表明，温度对烤烟成花的影响无本质作用且没有直接关系［54]。总的来说，低温诱导烟草早花需要建立在一定的条件下，烟苗的叶龄、温度的范围、诱导的时间长短以及烟草品种的耐寒性对是否造成早花均有影响，温度对烟草早花的影响与光对烟草生长发育的影响一样，仍需进一步系统的研究。

2.3 水分和养分

一般来说，适当的干旱有利于花芽分化，土壤渍水或干旱、移栽时的肥害、过量施用化学药剂、某些微量元素的过量吸收等都可以造成一定程度的早花［55，56]。有研究显示，低水平的氮有助于一些长日照作物的提早开花；而重金属元素铅和铁、钼等微量元素可影响光周期诱导及小麦等的春化作用［57]。洪鲲等［58]通过试验表明，不同配比的N、P、K、Ga会对马缨杜鹃花芽发育和花期产生影响，适量的施用N、P、K、Ga能调节植物的花期。借鉴其他作物的施肥研究不难发现，通过调控水肥管理或许能有效协调烟草的开花时间，目前这方面的研究很少。任雅君等［59]在对烟草喷施叶面肥KH2PO4的研究中发现，2.0% KH2PO4不利于烟草开花，0.5% KH2PO4有助于促进烟草开花，因此，当烟草种植中施用叶面肥时需注意把握施用量，以达到保证烟株正常生长并适时发育的目标，防止因化肥施用不当引起烟草早花。

3 烟草早花基因的研究技术

随着分子生物技术的不断发展，在了解了拟南芥等植物的开花基因序列及功能的基础上，可通过已知的基因序列设计引物，通过RT-PCR（reverse transcription PCR）及电泳检测技术，检测基因的相对表达量，通过测序分析未知基因片段与已知基因是否具有同源性、再通过克隆和转基因的方式与功能基因突变体相比较，检测该基因是否具有影响植物开花的功能，这些研究已得到了广泛的运用［60-63]。但是，由于植物生长发育是一个十分复杂的过程，涉及到众多基因的表达和调控，以往的研究局限于某一种或某一类基因的行为和功能，不能监测该基因或该类基因与其他基因的互作，无法从整个基因组水平进行研究，利用基因芯片技术，可以自动、快速、平行地检测目的材料中成千上万个基因的表达情况［64]。利用基因芯片检测作物中相关基因的表达的方法是多种多样的。许州达等［65]在分析了小麦与水稻基因的同源性后，利用水稻的基因芯片检测了小麦耐旱的相关基因的表达。曾黎琼等［66]通过GenBank搜索已发布的花序发育基因序列，设计特异性的引物，采用PCR法扩增，获得了相应的基因片段后利用这些基因片段制备基因芯片，然后用此芯片与已标记的非洲菊cDNA杂交，用以分析同一基因在非洲菊不同发育时期的表达情况和同一基因在不同肥料条件下的表达情况，但自行设计合成芯片的技术要求与合成成本较高。目前一些生物技术公司已合成了烟草基因芯片，其中包含了上万个烟草的基因，但很多基因的功能都还未知，其中许多与开花相关的基因的研究仍需要通过合成引物，利用RT-PCR检测、测序、序列比对等技术进行进一步的探索，以明确烟草中存在的开花基因。

4 小结

早花问题一直困扰着烟叶的生产，传统的研究思路单从环境因素和生理生化角度进行分析，但由于不同的产区气候条件的不同、栽培的烟草品种不一致而使研究结果难以定论。但是，就生产需要和目前的研究成果来说，有针对性地就某个地区、某特定品种进行早花研究仍然很有必要且需要更为深入的研究。结合各烟区气候条件不同，主栽品种不同，栽培习惯不一样，大田生产中烟草早花的预防需要结合各烟区实际情况。对烟草早花生理的理论研究则需要突破地域、品种的限制，除了对品种、光照、温度等因素进行单一的研究之外，还应将影响烟株生长发育的各个因素整合起来，结合地区、品种得到系统的研究结果，为实践提供有价值的参考信息。

分子生物学的发展推动了遗传育种研究的发展，研究烟草的开花基因，不仅能从分子机理角度解释调控开花的主要因素和过程，将各个途径整合成一个相互联系的系统。同时，若能在了解烟草开花基因的基础上利用分子设计育种技术选育出抗早花的烟草品种，对大田生产来说将是预防烟草早花更为直接、简洁的手段。值得注意的是，已知的开花基因的同源基因并不一定具有调控开花的作用，且不同作物中，同源基因的调控机理是存在一定差异的［68，69]，利用已知的开花基因寻找其他作物开花基因的研究需要通过基因克隆、测序以及转基因等手段调整目标基因在植物中的表达，再对其表型进行观测才能得出可靠结论。在烟草开花基因的研究基础上，考虑到基因表达最终是通过蛋白质的形式来表现，而且由于密码子的简并性，单凭DNA序列的测定不能完全说明问题，因此，对烟草进行蛋白质组的研究并将其与基因研究结果进行对比分析，能使研究结果更为可靠，但目前的研究水平离烟草开花蛋白的研究还有很长的一段路要走。

开花基因的研究为烟草早花的研究打开了一扇新的大门，但是，分子水平的研究只有在结合生理水平研究的基础上，将形成早花的生理机制、分子机制和环境因素相结合，才能全面真实的阐述并解决早花问题。随着烟草基因组测序的完成，我们相信烟草分子研究的时代已经到来，生理生化研究未能解决的问题，将在传统研究结合分子机理的研究中找寻到答案。

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