四倍体刺槐枝条韧皮部总蛋白质双向电泳体系建立及应用

张胜 赵忠，2 刘昭军 张博勇，2 宗建伟 张玲玲

（1.西北农林科技大学林学院，杨陵 712100；2.西北农林科技大学 西部环境与生态教育部重点实验室，杨凌 712100）

双向电泳技术由O’Farrell［1]于1975年首次建立，并成功分离约1 000个E. coli蛋白质。双向电泳是通过两个方向相互垂直的电泳，将样品中的蛋白质按照等电点和分子质量的不同而呈点状分离［2]。双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一［3]，对双向电泳技术的研究与探索是后续蛋白质组学研究的基础。双向电泳技术流程包括组织蛋白质的提取、第一向等电聚焦（IEF）、第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、凝胶染色、凝胶图像扫描及分析等基本步骤。对于双向凝胶电泳分析来说样品的制备，胶条、分离胶浓度选择，上样量控制，等电聚焦条件设置等都影响试验结果。因此，为了获得最佳的电泳分离效果需要建立一套稳定、高效的电泳条件组合。

组织蛋白质的提取是双向电泳技术研究的基础。蛋白质提取的好坏将直接影响2-D凝胶图谱质量。通常影响双向电泳结果的最主要的原因是样品的制备［4]。植物组织中含较多的非蛋白成分，如多糖、酚类、色素、脂类、单宁及其它次级代谢物，这些物质会对双向电泳图谱中蛋白质的分离产生一定的影响［5]。选择合适的蛋白质提取方式能够有效的去除杂质、纯化蛋白。TCA/丙酮法是一种提取植物总蛋白质的有效方法［6]，该方法已在小麦花药、叶片和籽粒［7，8]，番茄叶片［9，10]，大豆叶片［11]、种子［12]，甘蓝型油菜［13]等众多植物中取得了良好的效果。

由于四倍体刺槐的优良性状［14]，近年来对它的研究也陆续展开。四倍体刺槐从蛋白组学方面的研究虽然有过报道但从2D图谱上看蛋白质分离效果并不理想，图谱中有明显的横纵条纹，且背景不清楚、聚焦不完全。本研究从分离胶浓度、IPG胶条选择到上样量、等电聚焦参数等条件进行优化，旨在得到更为理想的、更便于分析的凝胶图谱。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品 供试材料为3年生四倍体刺槐根繁苗萌条，采自西北农林科技大学林学院苗圃。剪取四倍体刺槐生长健壮的枝段，用蒸馏水清洗后，刮取韧皮部并用锡箔纸包好放液氮内速冻，-80℃保存备用。

1.1.2 仪器和试剂 17 cm IPG干胶条（pH3-10、pH4-7、 pH5-8）（Bio-Rad），PROTEAN IEF Cell（Bio-Rad），PROTAIN IEF Cell型电泳系统（Bio-Rad），PowerLook2100XL扫描仪，PDQuest 2DE7.4分析软件（Bio-Rad）。药品均为分析纯，药品溶液均使用超纯水配置。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质的提取与定量

1.2.1.1 蛋白质的提取 四倍体刺槐全蛋白质的提取方法为三氯乙酸/丙酮沉淀法［15]，并加以改进：液氮预冷研钵，取2 g四倍体刺槐韧皮部样品，加入10% PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英砂，充分研磨。加入5倍体积-20℃预冷的10%三氯乙酸/丙酮溶液（含有0.07 %的β-巯基乙醇），涡旋震荡后-20℃静置2 h以上。4℃，1 100 r/min离心30 min，弃上清，沉淀复溶于冷丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），-20℃放置1 h。4℃，11 000 r/min离心30 min，弃上清，冷丙酮冲洗沉淀，重复2-3次；弃上清后放入通风厨自然挥发丙酮。将制成的干粉每克加入2 mL裂解液［7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% 3-（3-胆胺丙基）] 涡旋混匀，置于30℃水浴1 h，不时震荡，充分溶解蛋白。常温11 000 r/min离心30 min，取上清液，定量，-80℃分装保存备用。

1.2.1.2 蛋白质的定量 蛋白质定量使用天艮Bradford蛋白质定量试剂盒，得到标准曲线，利用标准曲线算出蛋白质大致浓度。

1.2.2 双向电泳分析（2-DE）

1.2.2.1 第一向固相pH梯度等电聚焦（IEF）将蛋白质样品与水化上样缓冲液（含8 mol/L尿素，2%CHAPS，0.001%溴酚蓝，45 mmol/L DTT，0.2% Biolyte pH3-10）充分混匀。取混合溶液350 μL，加入聚焦槽。将IPG胶条室温下放置10 min，胶面朝下，按正负极放入聚焦槽内，确保无气泡。在胶条上覆盖一层矿物油（2-3 mL）盖上聚焦槽盖，将聚焦槽放入Bio-Rad等电聚焦仪（PROTEAN IEF Cell，Bio-Rad Hercules，CA，USA）上。操作方法按照Bio-Rad聚焦程序操作手册《2-D Electrophoresis principle and methods》设定，在第一向程序设定上略作修改（表1）。在20℃条件下主动水化14 h，使胶条充分吸收蛋白质样品后按程序进行第一向等电聚焦电泳。

1.2.2.2 第二向垂直板电泳（SDS-PAGE） 第一向等电聚焦结束后，取出含蛋白样品的IPG胶条，放于水化盘中平衡，依次加入5 mL/gel平衡液A［平衡缓冲母液（6.0 mol/L尿素，2% SDS，0.375 mol/L Tris-HCl（pH8.8），20%甘油）+ 2% DTT（现加）] 和5 mL/gel平衡液B［平衡缓冲母液+2.5%碘乙酰胺（现加）] ，各平衡15 min。用1×电泳缓冲液稍冲洗IPG胶条后迅速转移至分离胶上端，挤压上端胶条，排净气泡，使IPG胶条与分离胶紧密接触。用1%低熔点琼脂糖凝胶封胶。将SDS-PAGE胶架放入PROTAIN IEF Cell 型电泳系统（Bio-Rad）中。加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用低电流（5 ma/gel/17 cm），待样品完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，加大电流（20-30 ma/gel/17 cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。卸下玻璃板，取出凝胶，超纯水冲洗2-3次后开始凝胶染色。

表1 等电聚焦程序设定

1.2.2.3 凝胶染色 本研究采用了两种染色方法对四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白进行染色。分别用与质谱兼容的考马斯亮蓝染色和灵敏度高的硝酸银染色。

硝酸银染色［16]第一步超纯水冲洗凝胶3次，固定1 h，固定液（40%无水乙醇+10%冰乙酸+50%超纯水）。第二步敏化30 min，敏化液（17 g乙酸钠+0.5 g硫代硫酸钠+75 mL无水乙醇+超纯水至250 mL）。第三步水洗3次×10 min。第四步染色，染色液［0.625 g碳酸钠+超纯水至250 mL（用时现加100 μL甲醛）] 。第五步水洗2次×1 min。第六步显色（视凝胶显现效果定）显色液［6.25 g碳酸钠+超纯水至250 mL（临用前加入50 μL甲醛）] 。第七步终止10 min，终止液（3.65 g Na2EDTA+超纯水至250 mL）。第八步水洗3次，每次5 min。

考马斯亮蓝染色参照参考文献［17] 稍作改动。其基本过程为：固定（40%乙醇+10%冰乙酸+50%纯水）30 min，洗涤3次，每次置于摇床上轻摇10 min，染色盘中加入考马斯亮蓝G-250染色液（1.2 g/L考马斯亮蓝G-250、100 g/L硫酸铵、100 g/L磷酸、20%乙醇）摇床摇动过夜。纯水重复脱色直至背景清楚。

1.2.2.4 凝胶图像分析 用PowerLook2100XL扫描仪扫描凝胶图像，扫描结果直接导入计算机（32位，400 dpi分辨率，全彩）。并用PDQuest 2DE7.4分析软件（美国Bio-Rad公司）分析（图像剪切、斑点检测等）。

2 结果

2.1 不同分离胶浓度的选择

采用10%、12%和15%的分离胶探讨了对四倍体刺槐韧皮部蛋白质的分离效果的影响。结果（图1）表明，分子量20 kD以下的蛋白质在10%的分离胶中（图1-A）未能得到分离，虽然分离度较大但条带不够清晰，av蛋白质没能完全的展现在凝胶上。蛋白点在12%的分离胶中（图1-B）能充分分开，且条带清晰蛋白质分布较均匀。用15%的分离胶（图1-C）可以看出蛋白质在整个凝胶板上是分布不均匀的；由于胶浓度太大，大分子蛋白质大量重叠，条带不够清晰。由以上结果可知，四倍体刺槐蛋白质的分离胶相对适宜浓度为12%，在后续试验中采用12%的分离胶。

2.2 不同IPG胶条pH梯度的选择

采用pH3-10、pH4-7、pH5-8的IPG胶条对四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白进行双向电泳，根据凝胶蛋白质点的分布结果选择最适合的pH梯度。为了尽可能多的，全面的显现四倍体刺槐枝段韧皮部蛋白质，在IPG胶条选择试验中采用灵敏度高的硝酸银染色法染色，上样量180 μg。通过pH3-10胶条（图2-A）发现，四倍体刺槐韧皮部蛋白质点主要分布在偏酸性和中性的区域，碱性区域蛋白质点相对较少。采取窄pH范围（pH4-7和pH5-8）的IPG胶条（图2-B和图2-C）进行双向电泳试验，两种胶条都能得到较好的凝胶图谱，且相比pH5-8的IPG胶条，使用pH4-7的IPG胶条能得到更多的蛋白质点，且蛋白点在凝胶图谱中分布均匀，斑点检测结果见表2。

表2 两种pH梯度下的蛋白质点数对比

2.3 考马斯亮蓝染色上样量的优化

图3中A-D四块胶分别表示上样量为400、450、550和650 μg 经考马斯亮蓝G-250染色后的2-DE图谱。四块凝胶中A、B的背景较C、D更清晰，且横纵条纹相对较少，但是A、B两块凝胶上样量少，蛋白质点数也较C、D凝胶少，丢失许多低丰度蛋白质。D凝胶，上样量较大，高峰度的蛋白质点将其周边蛋白质点覆盖，影响图像效果，C凝胶较D凝胶分辨率高且蛋白点更圆，见图3-CⅠ和图3-DⅢ区、3-CⅡ和图3-DⅣ区放大图。C凝胶虽然背景没有A、B清晰但蛋白质点数最多，而且蛋白质点形状更圆。4种不同上样量蛋白质点检测结果如表3所示。可见，采用考马斯亮蓝染色时550 μg的上样量对于四倍体刺槐韧皮部总蛋白2-DE分析是最佳的。

表 3 考马斯亮蓝染色不同上样量蛋白质点数对比

2.4 第一向等电聚焦时间的优化

等电点聚焦是影响双向电泳凝胶图像好坏的重要因素。聚焦时间同胶条pH梯度、长度、蛋白质上样量的大小有关。若聚焦不充分，会在凝胶图上呈现蛋白质点的横向条纹、蛋白质点不够圆等问题，最终影响分析结果。但聚焦时间过长也并不能改变分辨效果。Bio-Rad实验操作手册中将17 cm IPG胶条的总聚焦功率设为60 000 Vh，但60 000 Vh的总聚焦功率并不能将四倍体刺槐韧皮部蛋白充分聚焦，蛋白质凝胶图上横条纹较多（图4-A），且当上样量较大时不能充分聚焦的现象尤为明显。实际操作中将总聚焦功率设为80 000 Vh（表1），加大功率后凝胶图上基本消除了横条纹，且蛋白质点形状比较圆，如图4-B所示。

2.5 四倍体刺槐扦插愈伤组织阶段蛋白质组份分析

采用优化的体系分析四倍体刺槐扦插愈伤组织形成阶段蛋白质变化情况，经PowerLook2100XL扫描仪扫描凝胶图像，PDQuest7.4软件进行自动匹配结合肉眼观察及人工匹配，保留对照（0 d）370个，愈伤组织形成期（10 d）368个肉眼可见且点形较圆的斑点作为最后分析。结果（图5）显示，与对照（图5-A）相比在扦插10 d愈伤组织形成期（图5-B）共有83个差异蛋白质，其中上调蛋白质15个，新产生蛋白质22个，下调蛋白质22个，缺失表达24个。图6为个别差异蛋白质点的放大图，其中图6-A表示对照（0 d），图6-B为愈伤组织形成期。

3 讨论

对于蛋白质组学研究来说，高质量的双向电泳图谱是后续分析的基础，对研究材料进行双向电泳条件的优化是非常重要和必要的。合适的蛋白质提取方法能消除植物次生代谢物质的干扰，改善图谱质量。本研究以TCA/丙酮法提取全蛋白质，经双向电泳，得到的2-DE凝胶图谱背景清晰，蛋白质点较多。表明TCA/丙酮法适合四倍体刺槐枝段韧皮部全蛋白质的提取。不同的分离胶浓度会影响蛋白质分离的效果，丁承强等［18]在研究水稻根段组织双向电泳图谱中指出与12%的分离胶相比10%的分离胶使水稻根段组织蛋白质点分布更加均匀，在调整好上样量后能够分离到更多的蛋白质点。对于不同的植物需要选择合适浓度的分离胶来分离蛋白质，庄维兵等［19]发现10%的分离胶比较适合梅花芽蛋白质双向电泳，任丽萍等［20]用15%分离胶分离黄瓜叶片蛋白质效果较好。另外，合适的分离胶浓度有利于蛋白质分离，并且能在凝胶图谱上显现更多的蛋白质点，对于多数植物组织来说12%的分离胶浓度较适合蛋白质的分离［10，21-24]。对于四倍体刺槐韧皮部全蛋白质来说其蛋白质的分子量主要集中在20-120 kD的范围内，所以采用12%的分离胶是合适的。

适合的pH梯度能显著提高凝胶蛋白质点的分辨率。对于四倍体刺槐韧皮部全蛋白使用pH3-10胶条分离效果不好，从蛋白质图谱上分析得出大部分蛋白质大致集中在pH为4-8的范围内。采用窄pH梯度胶条后（pH4-7、pH5-8），凝胶背景、分离效果、分辨率都得到显著的提高。但是目前没有pH4-8的17 cm IPG胶条，所以选择蛋白质点数相对较多的pH范围胶条为分析所用。对于全面分析蛋白质来说可以对不同的pH范围跑出的凝胶图谱进行分别分析。

不同的染色方法所要求的上样量是不同的，17 cm的IPG胶条银染上样量在100-300 μg，考马斯亮蓝染色上用量1-3 mg。但是也因不同的样品而有所不同。上样量的大小直接影响双向电泳的分辨率［25]。双向电泳图谱的效果直接受蛋白质上样量的影响，上样量关系到试验结果的可靠性。提高上样量，有利于检测低丰度蛋白，但上样量过高时，会产生横纵条纹，高丰度蛋白质的斑点会影响其他蛋白质点的分离和分析［26]。上样量太小，低丰度蛋白无法显示在凝胶上；上样量过大凝胶背景不清，凝胶上出现大量的横条纹，高丰度蛋白形成遮盖效应使蛋白点分离度降低。所以探索最佳的上样量对于凝胶蛋白点分析很有意义，对于四倍体刺槐枝段韧皮部蛋白质双向电泳考马斯亮蓝染色上样量从400 μg增加到550 μg时蛋白点数也是呈上升趋势，但再增加100 μg时蛋白点数反而下降了，而且分辨率明显下降，原因是上样量较大，形成较多的横线和拖尾，影响蛋白点分析。

聚焦时间同胶条的长度、pH梯度、载体两性电解质以及蛋白质上样量有关［26]。Bio-Rad试验操作手册对等电聚焦做了参考的程序设置，但是在实际试验操作中需要根据自己实际的样品做调整，既要防止聚焦时间不够所造成图谱上大量横条纹、聚焦不完全和蛋白质点不圆，又要防止过聚焦所造成的横条纹和蛋白质因长时间聚焦所造成的损失。

采用优化的体系对四倍体刺槐扦插枝段韧皮部进行双向电泳，分析差异表达蛋白质，希望从蛋白质组学角度解释四倍体刺槐扦插生根机理。对于这些差异表达的蛋白质的质谱鉴定、数据库检索及蛋白质功能分析作者实验室正在进行中。

4 结论

本研究以TCA/丙酮法为蛋白质提取方法，采用pH4-7的17 cm IPG胶条，12%的分离胶浓度，考马斯亮蓝染色上样量550 μg，等电聚焦在60 000 Vh的基础上提高20 000 Vh能得到背景清晰、蛋白质点数多、分离度高且重复性好的电泳凝胶图谱，经过优化建立起了适合于四倍体刺槐枝段韧皮部双向电泳体系。用优化的体系对四倍体刺槐扦插当天（0 d）和愈伤组织形成阶段（10 d）采集的样品进行蛋白质双向电泳分离，将得到凝胶图谱经软件检测分析得到83个差异蛋白质点，其中上调蛋白15个，新产生蛋白22个，下调蛋白22个，缺失表达24个。

［1] O’Farrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins［J] . The Journal of Biological Chemistry, 1975, 250（10）：4007-4021.

［2] Görg A, Weiss W, et al. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics［J] . Proteomics, 2004, 4（1）：3665-3685.

［3] 马洪雨, 王占奎, 俞阗, 等.适用于黄麻根部蛋白质组学分析的双向电泳技术［J] .西北植物报, 2010, 30（1）：195-202.

［4] Wilkins MR, Appel RD, Williams KL, Hochstrasser DF. Proteome research：Concepts, technology and application［M] . Berlin Heidelberg：Springer-Verlag, 2007.

［5] Shaw MM, Riederer BM. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis［J] . Proteomics, 2003, 3：1408-1417.

［6] Jacobs DI, van Rijssen MS, van der Heijden R, Verpoorte R. Sequential solubilization of proteins precipitated with trichloroacetic acid in acetone from culturedCatharanthus roseuscells yields 52% more spots after two-dimensional electrophoresis［J] . Proteomics, 2001, 1（11）：1345-1350.

［7] 叶景秀, 陈蕊红, 张改生, 等.杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育花药蛋白质组分分析［J] .农业生物技术学, 2009, 17（5）：858-864.

［8] 宁书菊, 赵敏, 向小亮, 等.不同氮素水平下水稻生育后期叶片和籽粒的蛋白质组学［J] .应用生态学报, 2010, 21（10）：2573-2579.

［9] Saravanan RS, Rose JKC. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues［J] . Proteomics, 2004, 4（9）：2522-2532.

［10] 黎飞, 徐秋芳, 臧宪朋, 等.番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立［J] .园艺学报, 2010, 37（4）：661-668.

［11] 顾宪鹏, 罗秋兰, 高继国, 等.大豆叶片蛋白质双向电泳技术的改良［J] .大豆科学, 2011, 30（4）：663-667.

［12] De La Fuente M, Borrajo A, Bermudez J, et al. 2-DE-based proteomic analysis of common bean seeds［J] . Journal of proteomics, 2011, 74（2）：262-267.

［13] 甘露, 李殿荣, 臧新, 等.甘蓝型油菜蛋白质双向电泳体系的建立［J] .作物学报, 2010, 36（4）：612-619.

［14] 李云, 姜金仲.我国饲料型四倍体刺槐研究进展［J] .草业科学, 2006, 23（1）：41-46.

［15] Imin N, Kerim T, Weinman JJ, et al. Characterization of rice anther proteins expressed at the young microspore［J] . Proteomics,2001, 1（9）：1149-1161.

［16] Westermeier R, Naven T. Proteomics in practice：A laboratory manual of proteome analysis［M] . Weinheim：WILEYVCH Verlag GmbH, 2002.

［17] Candiano G, Bruschi M, Musante L, et al. Blue silver：A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis［J] . Electrophoresis, 2004, 25（9）：1327-1333.

［18] 丁承强, 马丹, 王绍华, 等.水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法［J] .植物学报, 2011, 46（1）：67-73.

［19] 庄维兵, 高志红, 章镇, 等.果梅花芽蛋白质双向电泳优化体系的建立［J] .南京农业大学学报, 2011, 34（6）：47-52.

［20] 任丽萍, 范海延, 王珊珊, 等.黄瓜叶片蛋白质双向电泳样品分级优化［J] .西北植物学报, 2011, 31（8）：1706-1710.

［21] 付忠军, 丁冬.进茜宁, 等.玉米花丝蛋白质组双向电泳条件的优化［J] .植物生理学通讯, 2009, 45（12）：1215-1220.

［22] 王娟, 倪志勇, 吕萌, 等.棉花纤维伸长期与次生壁增厚期蛋白质组比较［J] .作物学报, 2010, 36（11）：2004-2010.

［23] 顾宪鹏, 罗秋兰, 高继国, 等.大豆叶片蛋白质双向电泳技术的改良［J] .大豆科学, 2011, 30（4）：663-667.

［24] 王娟, 倪志勇, 吕萌, 等.棉花纤维伸长期与次生壁增厚期蛋白质组比较［J] .作物学报, 2010, 36（11）：2004-2010.

［25] 魏开华, 应天翼, 编著.蛋白质组学试验技术精编［M] .北京：化学工业出版社, 2010.

［26] Pasquali C, Fialka I, Huber LA. Preparative two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins［J] . Electrophoresis, 1997,18（14）：2573-2581