原生质体融合技术选育分解草酸乳酸菌菌株的研究

张禹 毛淑红 路福平 聂实践

（1. 天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 工业酶国家工程实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457；2.北京百林康源生物技术有限责任公司，北京 100069）

人体缺乏降解草酸的酶，体内的草酸一般通过肠道内微生物降解。1985年Allison［1]首次筛选出具草酸分解能力的产甲酸草酸杆菌，之后又发现粪肠球菌、雷氏普罗威登斯菌和乳酸菌具有不同程度的草酸分解能力。Lung［2]首次得到分解产甲酸草酸杆菌分解草酸的关键酶基因oxc和frc。国内郭照宇［3]对发酵乳制品中的乳酸菌进行筛，选得到37株具有草酸分解能力的乳酸菌，赵树田［4]对10种可制作酸奶的乳酸菌体外降解草酸能力评价，得到具有最高分解能力的是乳双歧杆菌。而现有发现得到的分解草酸的肠道微生物耐氧能力较差，为培养和生产微生态制剂带来了困难。为克服该问题，Turroni等［5]利用转基因技术对参与草酸代谢的草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶的克隆与表达做了相关研究。但转基因技术在食品领域存在着安全问题，而原生质体融合技术更为安全，同时操作更为简便，可以更快捷地得到重组菌。

本研究在国内外研究的基础上，选取具有草酸分解能力的乳双歧杆菌和具有耐氧特性的嗜酸乳杆菌作为亲本，通过双亲灭活进行原生质体融合，筛选可以在有氧环境生长并具有分解草酸能力的菌株

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactisDSM 10140）购于中国普通微生物保藏管理中心。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilusTCCC11275）保藏于天津科技大学菌种保藏中心。

1.1.2 培养基、溶液和试剂 乳双歧杆菌液体完全培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖5 g/L，K2HP40.45 g/L，KH2PO40.33 g/L，氯化铵1 g/L，硫酸镁0.1 g/L，L-半胱氨酸0.5 g/L，蒸馏水1 L，pH自然。

MRS液体培养基： 蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，K2HPO42 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，乙酸钠5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温80 1 mL/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，pH自然。

再生培养基：半固体MRS培养基（不含吐温80）中添加质量百分数为2.5%的明胶，浓度为20 mmol/L MgCl2，浓度为0.5 mol/L的蔗糖。

草酸培养基：草酸钠2.5 g/L，葡萄糖1.5 g/L，蛋白胨1 g/L，酵母提取物0.5 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO42 g/L，硫酸铵2 g/L，硫酸锰0.025 g/L。

原生质体稳定液PB［6]：0.02 mol/L HEPES，pH值为7.0，添加浓度为1 mmol/L的MgCl2，质量分数为0.5%的明胶，浓度为0.3 mol/L棉籽糖或浓度为0.5 mol/L的乳糖。

溶菌酶溶液：用原生质体稳定液PB配制成一定质量浓度的溶菌酶溶液，用一次性无菌滤器过滤除菌。

聚乙二醇 PEG 6000：用原生质体稳定液 PB 配制成一定质量浓度的的溶液115℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 分别取菌种乳双歧杆菌DSM 10140和嗜酸乳杆菌TCCC11275按质量分数为5%接种于乳双歧杆菌液体完全培养基和MRS液体培养基中37℃静置培养24 h。

1.2.2 原生质体制备与再生 取对数生长期15 mL菌液离心3 500 r/min，并以原生质体稳定液PB洗涤两次，用原生质体稳定液PB稀释至106-107个/mL，用完全培养基倾注法测定细胞数。转入9.0 cm培养皿中，加入一定质量体积的溶菌酶溶液处理一定时间，原生质体稳定液PB洗涤两次，用再生培养基倾注法测定细胞数。

1.2.3 原生质体灭活 高温灭活：取乳双歧杆菌原生质体细胞悬液5 mL在不同温度热水浴中，不同时间灭活后用再生培养基倾注法测定细胞数。紫外灭活：取嗜酸乳杆菌原生质体细胞悬液5 mL于9.0 cm灭菌平板中，置15 W紫外灯下，距离为30 cm照射不同时间后用再生培养基倾注法测定细胞数。

1.2.4 原生质体融合 将灭活后两亲本原生质体悬液在离心管中等体积混合，于4℃冷冻离心机中3 000 r/min离心10 min，然后加入不同配比质量百分数的PEG6000，融合前需使亲本的原生质体细胞浓度达到106-107个/mL，混匀后放入15℃、转速为100 r/min的恒温摇床中，10 min以待融合；取出融合后的原生质体悬液4℃冷冻离心后用PB缓冲液离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤后的原生质体重悬于PB缓冲液中，得到融合后的原生质体用再生培养基倾注法测定细胞数。

1.2.5 计算公式 原生质体形成率、原生质体再生率、原生质体灭活率和融合率计算公式参考文献［7] 。

1.2.6 分解草酸测定方法 将测试菌株转接到草酸培养基中于37℃培养5 d后，使用高效液相色谱法检测草酸培养基发酵前后的草酸含量，高效液相色谱法条件如下。色谱柱：C18柱5 μm，250×4.6 mm，pH范围：2-10，流动相：2% H3PO4的去离子水∶甲醇（V/V）=99.5∶0.5，检测器波长：210 nm，流速：0.5 mL/min。

2 结果

2.1 乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌原生质体制备条件的确定

选择原生质体最佳的制备条件不仅要使原生质体制备率达到最高，同时还要考虑原生质体再生率不能过低，因此由表1、表2、表3结果可知乳双歧杆菌的最佳原生质体制备条件：溶菌酶浓度为6 mg/mL，酶作用温度为37℃，酶作用时间为25 min。嗜酸乳杆菌的最佳原生质体制备条件：溶菌酶浓度为12 mg/mL，酶作用温度为37℃，酶作用时间为30 min。

表1 乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌原生质体制备溶菌酶浓度

表2 乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌原生质体制备溶菌酶作用温度

表3 乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌原生质体制备溶菌酶作用时间

2.2 双亲本原生质体灭活剂量的确定

原生质体紫外灭活和热灭活的试验结果，见表4、表5、表6。为保证原生质体的灭活率为100%，最后确定嗜酸乳杆菌的紫外灭活时间为100 s，乳双歧杆菌的高温灭活温度为65℃，时间为70s。

2.3 原生质体融合条件的确定

融合条件是得到融合子的关键因素，主要研究了PEG6000 浓度、 融合温度、 融合时间和无机离子浓度对原生质体融合率的影响。

表4 嗜酸乳杆菌原生质体紫外线灭活剂量

PEG可以使原生质体膜之间有效接触，有效地诱导原生质体融合［8]。由表7可知，融合率随PEG6000浓度升高增加到5.0%当浓度超过50%时，融合率下降到3.2%。因此选择PEG6000浓度为50%作为原生质体融合时的PEG浓度。

表5 乳双歧杆菌原生质体高温灭活温度

表 6 乳双歧杆菌原生质体高温灭活时间

表7 PEG浓度对融合率的影响

温度在一定程度上影响原生质体融合率，较高的温度可以增加性细胞膜流动性，降低PEG 黏度，有助于原生质体的融合。由表8可知，融合温度上升到30℃时，原生质体融合率提高到5.5%。温度继续升高后，融合率降低至2%。因此选择30℃作为融合温度。

表8 融合温度对融合率的影响

PEG融合处理时间大多数情况为 1-10 min，由于PEG 对细胞有一定的毒性，处理时间过长会导致原生质体失活不能再生［9]。由表9 可知，随着融合时间增加到 7min时，融合率提高到6.0%，当融合时间继续增加到11 min 时，原生质体的融合率则降为 4.8%，因此为了获得最大的融合率选择7 min作为原生质体的融合时间。加入一定浓度的Ca2+和Mg2+在原生质体融合过程中可以促进融合。

表9 融合时间对融合率的影响

由表10、表11结果可知，选择融合率最高时的浓度为0.02 mol/L的CaCl2和浓度为0.5 mol/L 的MgCl2作为原生质体融合时的Ca2浓度和Mg2+浓度。

表10 CaCl2浓度对融合率的影响

表11 MgCl2浓度对融合率的影响

2.4 融合子的筛选

在有氧条件的草酸培养基中，亲本乳双歧杆菌由于不耐氧无法生长，嗜酸乳杆菌由于不具有分解草酸的能力也无法生长，只有融合后完全继承亲本特性的融合子才能生长。在296株融合子中有57株可以在有氧条件下的草酸培养基中生长，使用高效液相色谱法对培养基中检测培养基接种前后的草酸含量进行重复试验检测，筛选出分解草酸能力较高的菌株SZY1-1、SZY1-4、SZY1-7、SZY2-1、SZY2-2和SZY3-4，见表12。

3 讨论

原生质体融合可以使两亲本细胞随机融合，有效地筛选具有双亲特性的融合菌株，罗红霞等［10]对乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus，LN1#）双亲灭活进行原生质体融合得到在高温条件下产酸较强低，温条件下产酸较弱的融合菌株。黄明深［11]利用有芽孢的整肠生菌株（Bacillus licheniformis）与无芽孢的保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus）作为亲本，进行原生质体融合，得到了乳酸产量高于亲本菌株的融合菌株。原生质体融合的筛选方法是得到融合菌的重要环节，比较有效的是使用抗生素标记筛选，但在益生菌研究领域抗生素标记的使用却存在着安全问题。本研究双亲灭活原生质体融合后利用耐氧特性和耐草酸生长特性的进行筛选，不需要引入抗生素标记，可直接作为安全益生菌用于预防和治疗结石病。

表12 融合子分解草酸能力测定

本研究原生质体融合率偏低，还需进一步研究提高，以筛选得到草酸分解能力高于亲本的融合菌株。张莉滟等［12]使用电融合技术对双歧杆菌和热灭活的乳杆菌进行融合，通过生长特性以及初步生化试验鉴定得到融合子，虽然通过电融合的方法提高融合率，但在筛选方法上还不够完全。周正红等［13]对黑曲霉原生质体的进行了电融合的研究，融合率可达60%，相对于PEG诱导的融合率显著提高，后续研究可以对原生质体电融合方法进行探讨，以提高融合率得到更多高效分解草酸的融合子。

4 结论

本研究确定了原生质体融合最佳条件为50%的PEG 6000，融合温度30℃，融合时间为7 min，CaCl2浓度为0.02 mol/L，MgCl2浓度为0.5 mol/L，在此条件下融合率可达7.6%。筛选出一株草酸分解率为13.4%并可以在有氧条件下生长的融合子。

［1] Allison MJ, Dawson KA, Mayberry WR. Oxalobacter formigenes gen. nov., sp. nov.：oxalate-degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinal tract［J] . Arch Microbiol, 1985, 141（1）：1-7.

［2] Lung HY, Baetz AL, Peck AB. Molecular cloning, DNA sequence,and gene expression of the oxalyl-coenzyme A decarboxylase gene,oxc, from the bacteriumOxalobacter formigenes［J] . J Bacteriol,1994, 176（8）：2468-72.

［3] 郭照宇, 平云婕, 刘畅. 高效降解草酸乳酸菌的筛选［J] . 中国微生态学杂志, 2010（1）：36-39.

［4] 赵树田, 张士青, 顾欣. 十种可制作酸奶的乳酸菌体外降解草酸能力评价［J] . 上海交通大学学报：医学版, 2009（12）：1463-1466.

［5] Turroni S, Bendazzoli C, Dipalo SC. Oxalate-degrading activity inBifidobacterium animalissubsp.lactis：impact of acidic conditions on the transcriptional levels of the oxalyl coenzyme A（CoA）decarboxylase and formyl-CoA transferase genes［J] . Appl Environ Microbiol, 2010, 76（16）：5609-5620.

［6] Lee-Wickner LJ, Chassy BM. Production and regeneration ofLactobacillus caseiprotoplasts［J] . Appl Environ Microbiol, 1984, 48（5）：994-1000.

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［11] 黄明深. 保加利亚乳酸杆菌与整肠生菌进行原生质体融合的研究［J] . 中国乳品工业, 2006（9）：20-22.

［12] 张莉滟, 张德纯. 双歧杆菌与乳杆菌原生质体的融合及筛选［J] . 生物技术, 2003（4）：14-15.

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