四种测定纤维素酶发酵过程生物量方法的比较

李晨 赫荣琳 武改红 马立娟 路福平 陈树林

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.中国科学院天津工业生物技术研究所 天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，天津 300308）

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。根据纤维素酶系中各种酶组分的功能不同，纤维素酶可分为三大类：内切葡聚糖苷酶（endo-β-1，4-glucanase，EG，EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖苷酶（exo-β-1，4-glucanase，CBH，EC3.2.1.94）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，CB，EC 3.2.1.21）。除此之外，近年来新的纤维素酶组分也不断被发现。利用纤维素酶降解纤维素的优点在于特异性高，反应条件温和，环境污染小。随着人们对纤维素酶分子结构及作用机理等各方面的研究工作的深入，纤维素酶已在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。

现有的纤维素酶生产方法主要采用微生物液体发酵法，生产菌株以里氏木霉（Trichoderma reesei）及其近缘菌株应用最为广泛［1－3]。此外，真菌纤维素酶多数是诱导酶，其合成及表达须在诱导物存在下才能进行，而廉价的纤维素类物质作为纤维素酶液体发酵的原料其本身就是良好的诱导剂。但是，由于纤维素类物质是不溶于水的，为检测纤维素酶发酵过程中的生物量带来了很大难度而发酵过程中生物量不但是生产中发酵工艺优化及过程控制必需监测的指标，同时也是过程传质、物质转化及酶合成等理论研究方面的一个重要的参数［4－6]。测定菌丝体蛋白的方法［7，8]、测定核酸的方法［9]和酸洗干燥法［10，11]均被文献报道过用来测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量，但是这几种方法均存在各自的优缺点。如前两种方法均需以可溶性碳源为底物进行纯培养以做出标准曲线，处理过程、测定步骤繁琐，导致测定结果存在一定的误差。后一种方法虽然简单，但是由于酸处理后需反复洗涤沉淀以及干燥称重本身也存在较大误差。纤维素测定仪的方法由于受仪器本身的限制未见文献报道应用于测定纤维素酶发酵过程中的生物量。

因此，本研究在大量测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中生物量的基础上，分别采用测定菌丝体蛋白、测定核酸、酸洗干燥和纤维素测定仪4种方法对生物量进行分析检测，同时在精密度、误差分析以及影响因素等方面对几种方法进行比较，通过对测定结果进行统计检验，综合分析各方法的优缺点，以期为精确、快速地测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量提供选择方法的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 冰醋酸、浓硝酸、氢氧化钠、三氯乙酸、十水硼酸钠、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠和无水磷酸氢二钠均为实验室常规试剂，分析纯；乙二醇乙醚为有机溶剂；牛血清白蛋白（BSA）为生化试剂，购于Sigma；试验用水为二次重蒸水。

中性洗液配制如下：将6.81 g十水硼酸钠和18.61 g 乙二胺四乙酸二钠放入烧杯中加热并用蒸馏水溶解，加入30 g十二烷基硫酸钠和10 mL乙二醇乙醚；同时，用蒸馏水单独溶解4.56 g磷酸氢二钠直至其完全溶解；将两种溶液混合，并用蒸馏水定容至1 000 mL，控制pH 值在6.9和7.1之间。

1.1.2 仪器与设备 连续波长酶标仪（SPECTRAMAX 340PC384，美国Molecular Devices公司），纤维素测定仪（FIWE6，意大利VELP公司），离心机（SIGMA 3-18K型，德国Sigma公司），恒温水浴锅（XMTD-6000，北京市长风仪器仪表公司），台式冷冻干燥机（FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司），电热鼓风干燥箱（DHG-9140A型，上海一恒科学仪器有限公司）。

1.1.3 样品 试验中分析所用样品为采用本实验室保藏的里氏木霉（Trichoderma reesei）Rut C-30突变株30s-3-13于5 L发酵罐发酵36 h取样所得。

1.2 方法

1.2.1 测定菌丝体蛋白的方法 精密称取提前以可溶性碳源为底物培养好的0.3 g纯的干菌丝体，悬浮于装有15 mL、0.2 mol/L NaOH的50 mL离心管中，将该悬浮液置于沸水浴中20 min后，取出离心管静置12 h，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，采用Bradford法测定上清液中的蛋白浓度。

取10 mL发酵液样品于50 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min后，弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤3次，按照上述步骤提取菌丝体蛋白，即将洗涤后的沉淀物悬浮于15 mL、0.2 mol/L NaOH中，置于沸水浴20 min后，取出静置12 h，测定样品上清液中的蛋白浓度。按照下式计算生物量：

式中：C1-样品中蛋白浓度（g/L），C2-纯菌体上清中蛋白浓度（g/L）。

1.2.2 测定核酸的方法 精密称取提前以可溶性碳源为底物培养好的纯的干菌丝0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g，分别置于装有25 mL 5%的三氯乙酸溶液的50 mL离心管中，于80℃水浴提取25 min，同时用玻璃棒不间断进行搅拌，取出后水浴冷却，于4℃8 000 r/min离心15 min，将上清液进行适当稀释，以5%三氯乙酸作为零点对照，分别于260 nm处测定吸光度，以菌体质量为横坐标，260 nm处吸光值为纵坐标，做标准曲线（图1）。菌体质量在0-0.8 g范围内线性关系良好，其回归方程为y=1.2412x，R2=0.9988。其中，x为菌体质量（g），y为OD260。

取10 mL发酵液样品于50 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min后，弃去上清液，沉淀于-60℃冷冻真空干燥至恒重后，采用与上述相同的处理方法，260 nm处测定吸光值。按照下式计算生物量：

1.2.3 酸洗干燥法 取10 mL发酵液样品于50 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min后，弃去上清液，沉淀物于-60℃真空干燥至恒重后称重。将干燥后的沉淀悬浮于3 mL醋酸-硝酸溶剂中（150 mL 80%醋酸与15 mL纯硝酸混合），置于沸水浴中30 min，冷却后，4 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀物用10 mL蒸馏水洗涤2－3次，于40℃减压干燥至恒重。6个平行样测定。按照下式计算生物量：

式中：M1为发酵液离心后底物总干重（g），M2为经过酸处理后剩余底物的干重（g）。

1.2.4 纤维素测定仪的方法 取10 mL发酵液样品于50 mL离心管中，4 000 r/min离心10 min后，弃去上清液，沉淀物于-60℃真空干燥至恒重后称重，将干燥后的沉淀放入恒重好的坩埚内，加入100 mL中性洗液，0.5 g亚硫酸钠和几滴辛醇，加热至沸腾，并从沸腾开始计时，回流60 min。用沸水过滤并清洗3 次，然后用冷丙酮清洗2次。于105℃干燥8 h，放于干燥器中冷却，称重。按照下式计算生物量：

式中：M1为发酵液离心后底物干重（g），M2为残渣重（g）。

2 结果

2.1 测定结果与精密度分析

采用4种方法测定以不溶性纤维素为底物发酵36 h后生物量的结果见表1。由表1可见，采用测定核酸的方法所测得的结果最大，生物量为16.97 g/L；酸洗干燥法和纤维素测定仪法的测定结果较为接近，生物量分别为15.74 g/L和15.6 g/L；测定菌丝体蛋白的方法所测得的结果最低，为14.28 g/L。由此可见，由于各种方法的测定过程及其影响因素不同，采用几种方法所测得的生物量的值存在一定的差异。

同时，由表1可见，采用4种方法多次测定结果的相对标准偏差（RSD）值均在10%以内，认为各测定结果准确有效。其中，采用测定核酸的方法结果RSD值最小，为6.32%，酸洗干燥法最大，为8.23%。由于RSD值通常用来表示分析测试结果的精密度，因此，几种方法相比，采用测定核酸的方法来测定生物量的结果精密度最高，纤维素测定仪的方法和菌丝体蛋白法次之，酸洗干燥法最差。

表1 不同方法测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中生物量的结果

2.2 测定方法差异性检验

以精密度最高的核酸测定法所得的结果为标准，对其余3种方法与核酸测定法在测定结果的平均值的差异程度上进行配对t检验，计算公式如下［12， 13， 14]：

利用公式（5）-（7），计算得到t值结果见表2。同时，测定次数为6次，即n= 6，代入公式（8）计算得df= 5，因此，查t介值表t0.05（5）=2.571。由表2中数据可知，3种方法的t值均小于2.571，即小于t0.05（5），说明P>0.05，因此，t检验结果表明，这4种方法的测定结果平均值之间的差异不显著，均可作为以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中生物量的测定方法。但是，由于核酸法具有较高的精密度，可作为较精确监测以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中生物量变化趋势的方法，但是，由于该方法需要以可溶性碳源为底物进行菌丝体纯培养，从而进行换算以确定发酵过程中生物量的绝对值，导致操作步骤繁琐，测定过程耗时较长，而酸洗干燥法和纤维素测定仪法则可代替核酸法和菌丝体蛋白法来直接测定不溶性底物纤维素的含量，同时也得到发酵过程中的生物量。

表2 不同方法测定结果的t检验

3 讨论

测定菌丝体蛋白、酸洗干燥以及测定核酸的方法通常被文献报道用来检测以廉价的不可溶性纤维素底物为原料发酵产纤维素酶过程中的生物量。但是，几种测定方法均存在优缺点。本研究综合比较了上述3种方法以及尚未见文献报道过的纤维素测定仪的方法，从测定结果可见，采用不同方法所测得的生物量的值存在一定的差异，这可由这4种测定方法的检测步骤来解释。首先，核酸测定法需要先将细胞破壁，提取核酸，通过显色反应，测定吸光度，然后结合可溶性碳源培养的菌体采用相同方法处理得到的标准曲线，计算得到样品的生物量。该方法产生的误差主要在细胞破壁提取核酸环节，如提取温度、时间以及搅拌方式等均是影响细胞破壁程度的因素，进而影响生物量测定结果的准确性。同时，该方法需要提前以可溶性碳源为底物进行菌丝体纯培养，以制定标准曲线，因此，该方法操作过程耗时较长。测定菌丝体蛋白的方法与核酸测定法的原理类似，其过程是直接采用氢氧化钠对发酵液沉淀进行处理，溶解出菌体中的蛋白质，测定溶解出的蛋白量，结合采用可溶性碳源为底物培养得到的纯的菌丝体，通过一定的系数进行计算得到的生物量。采用可溶性碳源为底物培养所得的纯菌丝体，其细胞内的蛋白含量较以不可溶性纤维素为底物发酵所得菌丝体中的蛋白含量要低一些，因此，采用纯的菌丝体作为参考，导致所测得的生物量偏低。与核酸测定法所得的结果相差2.69 g/L。

酸洗干燥法和纤维素测定仪法的测定原理类似，均是采用试剂对发酵液沉淀进行处理，以除去沉淀中的菌体，测定不溶底物纤维素的含量，然后利用总干重与底物纤维素含量的差值进行计算得到相应的生物量。因此，采用这两种方法测得的结果相差不大，仅为0.14 g/L。在这两种测定方法中，经过试剂处理后，需要经过反复的洗涤离心，部分沉淀在去上清的过程中会损失掉，造成测定结果存在一定的误差。此外，由于沉淀以及坩埚均需干燥至恒重，以及中性洗液处理样品需沸腾回流1 h等，使得纤维素测定仪的方法操作时间也较长。

检测以不溶性纤维素为底物进行发酵产纤维素酶过程中的生物量，需要一个精密度高、误差相对较小以及操作相对较为简便的方法，由此可见，采用精密度较高的测定核酸的方法可较精确地测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量，采用精密度稍差但操作较为简单的酸洗干燥法也可用于普通常规检测分析，而纤维素测定仪的方法精密度高于酸洗干燥法但测定过程稍显繁杂，其更多还是应用于测定木质纤维素类生物质的组分含量分析上，但如果需要同时较精确的直接测定底物纤维素和生物量，采用纤维素测定仪的方法是较好的选择。由本文中对几种方法测定结果的比较可见，文献报道中较多采用的菌丝体蛋白法无论是在精密度上还是操作简便性上均无优势可言。

4 结论

本研究通过采用4种不同的方法测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量，测定核酸的方法精密度最高，可较精确地测定以不溶性纤维素为底物发酵产纤维素酶过程中的生物量，酸洗干燥法精密度较差但其操作较为简便，可用于常规监测，而纤维素测定仪的方法可同时较精确的测定底物纤维素和生物量。菌丝体蛋白法无论是在精密度上还是操作简便性上均不占优势。

［1] Martinez D, Berka RM, et al. Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungusTrichoderma reesei（syn. Hypocrea jecorina）［J] . Nature Biotechnology, 2008, 26：553-560.

［2] 覃玲灵, 何钢, 陈介南. 里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展［J] . 生物技术通报, 2011（5）：43-49.

［3] Chandra M, Kalra A, Sangwan NS, et al. Development of a mutant ofTrichoderma citrinoviridefor enhanced production of cellulases［J] . Bioresource Technology, 2009, 100： 1659-1662.

［4] Bader J, Klingspohn U, Bellgardt KH, Schugerl K. Modeling and simulation of the growth and enzyme production ofTrichoderma reeseiRut C30［J] . Journal of Bitechnology, 1993, 29： 121-135.

［5] Velkovska S, Marten MR, Ollis DF. Kinetic model for batch cellulase production byTrichoderma reeseiRUT C30［J] . Journal of Biotechnology, 1997, 54： 83-94.

［6] Muthuvelayudham R, Viruthagiri T. Fermentative production and kinetics of cellulase protein onTrichoderma reeseiusing sugarcane bagasse and rice straw［J] . African Journal of Biotechnology,2006, 5（20）： 1873-1881.

［7] Mohagheghi A, Grohmann K, Wyman CE. Production of cellulase on mixtures of xylose and cellulose in a fed-batch process［J] .Biotechnology and Bioengineering, 1990, 35： 211-216.

［8] He J, Yu B, Zhang KY, Ding XM, Chen DW. Strain improvement ofTrichoderma reeseiRut C-30 for increased cellulase production［J] .Indian Journal of Microbiology, 2009, 49：188-195.

［9] Prasetyo J, Zhu J, et al. Efficient production of cellulase in the culture ofAcremonium cellulolyticususing untreated waste paper sludge［J] . Biotechnology Progress, 2011, 27（1）： 104-110.

［10] Ahamed A, Vermette P. Culture-based strategies to enhance cellulase enzyme production fromTrichoderma reeseiRUT-C30 in bioreactor culture conditions［J] . Biochemical Engineering Journal, 2008, 40： 399-407.

［11] Ahamed A, Vermette P. Effect of culture medium composition onTrichoderma reesei’s morphology and cellulase production［J] .Bioresource Technology, 2009, 100： 5979-5987.

［12] 陈宇鸿, 沈仁富. 虾米中氯化钠不同测定方法的对比研究［J] .中国卫生检验杂志, 2011, 21（12）：3010-3011.

［13] 张琦, 杨先泉. 从污染物微核检测实验分析实验误差原因［J] .生物学通报, 2011, 46（10）：57-59.

［14] 韩丙军, 何秀芬, 张月, 等. 叶面肥中磷含量测定方法的比较研究［J] . 中国土壤与肥料, 2011, 6：83-86.