转基因水稻华恢1号检测用质粒标准分子研制

李亮 王晶 臧超 隋志伟 赵正宜

（中国计量科学研究院，北京 100013）

《2011年全球生物技术/转基因作物商业化态势》（年报43）作者、ISAAA主席Clive James博士强调：2011年转基因作物种植面积较2010年增长8%，即1 200万hm2；来自全球29个国家的农民中约有1亿人次种植了转基因作物，且累积种植面积超过12.5亿hm2（超过美国或中国25%的国土面积）［1]。

中国在1997年就已经开始有转基因植物获得安全证书，到目前为止已有8种植物获批。最具备里程碑意义的是：2009年11月27日通过了对转基因Bt水稻和植酸酶玉米的生物安全认证，这一举措对转基因作物在中国、亚洲乃至全世界的应用产生重大影响［2]。其中“华恢1号（TT51-1）”的获批意味着转基因水稻朝着水稻原产国和水稻消费大国——中国的商业化生产大门迈出了实质性的一步。

随着转基因水稻的获批，转基因作物及产品的定性与定量检测随之而来。质粒分子具有易于富集，非植物来源，可以高效、快捷获得无限稳定量的优点，同时也解决了难以获得植物阳性基因组DNA对检测所带来的问题［3]。转基因水稻华恢1号质粒标准分子（pTT51）按照国家一级标准物质技术规范（JJF 1006-94）［4]进行研制，可用于转基因定量检测和安全评价、实验室质量控制等领域。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 转基因水稻华恢1号种子由上海交通大学提供；pEASY-T3质粒载体购自北京全式金公司。

1.1.2 试剂与仪器 TaqMan®Universal Master Mix购自Applied Biosystems公司；正反向引物、TaqMan探针均由Invitrogen上海公司合成；基因组提取试剂盒Wizard®Magnetic DNA Purification System for Food procedure和质粒提取试剂盒购于Promega公司；实时荧光定量PCR仪为LightCycler®480 II；紫外分光光度计DU-800购自贝克曼公司；电泳仪和凝胶成像系统采用BioRad公司产品等。

1.2 方法

1.2.1 质粒分子的制备 通过查阅转化体的相关资料，选取华恢1号转化体特异性（外源基因）序列，长120 bp，单拷贝［5]；选取RBE4基因片段，长106 bp，单拷贝［6]作为内标准基因序列（图1）。

图1 转化体特异性序列和内标准基因序列

构建得到的质粒pTT51-1转化入大肠杆菌受体菌JM109中，以氨苄青霉素为筛选标记，确认阳性克隆后在LB培养液中进行大量培养，然后利用质粒提取试剂盒进行提取和纯化。

分别采用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳法、紫外分光光度法判断DNA的纯度及浓度，以及选择3家测序实验室来验证质粒片段的正确性。

1.2.2 实时荧光定量PCR反应的引物和探针 试验共需要两对引物和相应的探针，引物和探针序列设计参考文献［7] ，由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，序列见表1。

1.2.3 特异性检测 为验证质粒标准分子的特异性，采用不同作物转化体的内源、外源特异性引物分别对质粒分子进行扩增。选取转基因玉米BT176、转基因大豆MON89788和转基因棉花MON1445三种转化体，分别采用内、外源引物对3种转化体基因组及质粒分子进行扩增。

表1 外源基因和内标准基因的引物及探针序列

1.2.4 替代性研究 实时荧光定量PCR试验时，完全依赖质粒标准分子而不使用其它标准物质是不可能的。问题在于质粒和基体在定量中是否可以替代，因为不可能保证每个质粒分子同植物基因改良样品的拷贝数相比都产生11的结果，因为相关效率和转基因作物的外源基因片段和内标准基因片段也许发生了变化［7]。对质粒与基体进行可替代性研究，采用qPCR方法，即指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。采用外源基因和内标准基因扩增的Cq值［8]（每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环）相比的方法，通过qPCR随机取样进行分析。主要考察标准曲线的扩增效率和线性拟合度（R2）。

1.2.5 均匀性分析 均匀性分析同样采用qPCR技术，在DNA序列的固有特征一致的前提下，试验证明批次间的序列比值没有差异。通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，二者之比小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的［9]。

pTT51共制备了500管标准分子，每管500 μL，随即取样单元为15管，分别标记1-15。15管pTT51进行实时荧光PCR的方法进行扩增。

1.2.6 稳定性检验 稳定性是指在规定的时间间隔和环境条件下，标准物质的特性量值保持在规定范围内的性质［8]，即用来描述特性量值随时间变化的。稳定性分析方法：采用外源基因和内标准基因扩增的Cq值相比的方法，通过qPCR随机取样进行分析。

1.2.7 定值和不确定度评估 定值结果通过实时荧光定量PCR方法计算Cq比值为参考值，然后对pTT51治理分子标准物质进行测量不确定度评估。

2 结果

2.1 质粒

2.1.1 质粒分子构建 将PCR扩增转化体目标DNA片段（120 bp）和内标准基因DNA片段（106 bp）通过重叠技术构建到载体pEASY-T3上，命名为pTT51，物理图谱见图1。

2.1.2 质粒分子的纯化和质量分析 构建得到的质粒转化入大肠杆菌受体菌中，菌种保藏在-70℃冰箱，以载体氨苄青霉素（Amp）抗性为筛选标记。质粒的大量制备由保藏的菌种开始，首先使菌种复壮，划平板挑取单克隆菌落在LB培养液中进行大量培养，然后采用质粒提取试剂盒Promega A2393进行提取和纯化。

用紫外分光光度法测定所提DNA的浓度与纯度，OD260/OD280值应在1.8-2.0之内，OD260/OD230值应该大于2。测定结果（表1）显示均在要求范围内。

表1 pTT51质粒分子的紫外测定结果

通过测序分析来验证构建质粒片段的正确性及连入的拷贝数，采用三家实验室的测序，即上海英潍捷基生物技术有限公司、生工生物工程有限公司和北京诺赛基因组研究中心。测序结果表明连入片段与图1一致，并且为单拷贝连入。

2.1.3 特异性检测 选取转基因玉米BT176、转基因大豆MON89788和转基因棉花MON1445三种转化体，分别采用内、外源引物对3种转化体基因组及pTT51质粒分子进行扩增，结果（图2，图3）显示，pTT51内、外源引物可扩增出目的条带，为阳性，而其它作物检测结果及空白对照（NTC）为阴性，因此说明pTT51质粒分子的内、外源基因针对其它引物特异性良好。

2.2 替代性研究

2.2.1 PCR扩增效率的分析评价 采用方差分析的F分布假设检验。一般认为在95%的置信区间内，取α=0.05，即临界P值。若最后算得的P值>0.05，即在F分布的95%的区间内，认为两组数据没有差别。若最后算得的P值<0.05，即在小概率区间内，认为两组数据有显著性差别。

通过基因组DNA和质粒DNA扩增效率的比较（表2）发现，两者的内外源扩增效率并没有显著的差别（P均大于0.05），说明质粒DNA的扩增效率与基因组DNA是相似的。

表2 基因组DNA和质粒DNA扩增效率的比较

2.2.2 线性拟合度的分析评价 由试验数据可知，华恢1号基体DNA和质粒DNA的R2在0.992-1.000之间。通过基因组DNA和质粒DNA的R2比较（表3），发现两者的内源线性拟合度和外源线性拟合度均无显著差异（P>0.05），可以互相替代为阳性标准物质，进行定量检测。

表3 基因组DNA和质粒DNA 的R2比较

通过试验数据分析，分别对转基因水稻华恢1号基体和质粒分子的扩增效率和线性拟合度分别进行了可替代性的评价，结果发现基体和质粒分子具有相似的扩增效率和线性拟合度。在实际定量操作中可以互相替代作为阳性标准物质。

2.3 均匀性检验

将外源和内源Cq值相比后，采用F检验的方法对实时定量PCR所获得的数据进行分析，结果（表4）表明F

表4 pTT51管间均匀性分析结果

2.4 稳定性检验

一般短期稳定性研究4周，长期稳定性进行6个月或1年。按ISO导则35［9]关于稳定性评价的方法对标准物质的长期稳定性进行评价。

短期稳定性分析：分别存储在-20℃、4℃或25℃，达1、2、3、4周，各3管样本，每管分成3个子组（N=3，n=3）。一个存储在70℃的同种样本做参照。每个样本3次重复，通过qPCR对两个序列含量进行分析，结果见表5。

表5 pTT51短期稳定性统计结果

长期稳定性试验：将冻存管放置在-70℃（参照温度），-20℃，达1、2、3、6个月进行。3个不同的管在每个温度下通过qPCR同时分别进行3个重复的测试（5 μL pDNA每个PCR反应）。数据经格拉布斯检验无离群值需要剔除，已统计6个月，见图9。自由度n-2=3，P=0.95，t=2.352，b1=0.0002，t*S（b1）= 0.004642，故此b1

2.5 定值

定值结果通过qPCR的方法计算Cq比值为参考值。

2.5.1 参考值的确定 将测定的pTT51质粒分子的外源基因片段与内源基因片段之比（n=44）的结果为0.967，相对标准偏差RSD为0.013。

2.5.2 参考值的不确定度评定 标准物质的参考值确定后，还要对测量结果的不确定度进行分析。总不确定度由3部分组成：第一部分是通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计方法计算出；第二部分是通过对测量影响参数和影响函数的分析估计出；第三部分是物质不均匀性和物质在有效期内的变动性所起的不确定度。

A类不确定度的评估（UA）：该分量是通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计方法计算出的不确定度。

B类不确定度评估（UB）：通过对测量影响因素的分析，得出B类不确定度的分量（UB）。该分量与标准物质研制的整个过程有关，本研究主要考虑移液器等所有过程。

移液器引入的不确定度，按照试验方法中涉及的移液器以及所用体积。移液器带来的不确定度主要由各种移液器的校准偏差引入，包括使用到的各种量程的移液器偏差。

因此urel（v）=0.0016

标准物质不均匀性引起的不确定度的评定（UH）：由本质粒的研制报告可知，样品经均匀性检验后是均匀的，所以此部分的贡献为：

标准物质稳定性引起的不确定度（UT）：按照ISO导则35的方法，对标准物质的长期稳定性进行检验，选取0，1，2，3，6三个月的外/内源Cq值比值进行计算。由于斜率变化是不显著的。因而未观测到不稳定性。St=Sb·t=0.012

合成标准不确定度UC为：

将以上4个部分的相对不确定度合成，在扩展因子为2时，得到合成标准不确定度为：

U=0.024

3 讨论

植物组织的难获取时，或者不频繁使用标准品时，质粒分子可以方便而迅速的获得，并且达到检测目的。目前市场上仅有4种质粒分子标准物质，分别用于检测：转基因玉米MON810（ERM-AD413）、转基因玉米NK603（ERM-AD415）、转基因大豆356043（ERM-AD425）、转基因玉米98140（ERMAD427）。相对已经上市的近200转化体而言，质粒标准分子的市场研发前景是巨大的。质粒标准分子已经成为解决转基因作物检测有效性的新途径之一。

我国转基因生物标识制度中，未设置标识阈值。目前我国已发布的转基因检测标准大都是通过常规PCR方法进行定性检测，或者利用实时荧光PCR方法进行检测但仅做定性判断。而在实施强制性标识的大部分国家和地区，都设置了标识阈值，并将实时荧光定量PCR方法作为转基因检测的标准化方法。如欧盟、日本、韩国规定，对食品及饲料中转基因成分标识的阈值分别为0.9%、5%与3%，并建立了相应的定量检测方法。面对不断发生的转基因事件、针对国际转基因成分标识的现状，我国迫切需要加大开展转基因生物定量检测技术研发的力度，建立完善、规范的定量检测技术体系，并在此基础上加快开展定量检测标准的研制。

4 结论

本研究严格按照国家一级标准物质制备，通过qPCR的方法计算Cq比值为参考值，结果为0.967。经不确定度评价，pTT51质粒分子标准物质的扩展不确定度为0.024，可以替代基因组作为阳性标准品应用于实验室质控、含量检测及贸易争端等领域。

［1] James C. 2011年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势［J] .中国生物工程杂志, 2012, 32（1）：1-14.

［2] 李亮. II型EPSP合酶的功能域鉴定及大肠杆菌在草甘膦冲击下的基因表达谱分析［D] .北京：中国农业科学院, 2010：18。

［3] 苏长青, 谢家建, 王奕海, 等.转基因水稻Bt汕优63的整合结构和品系特异性定量PCR方法［J] .农业生物技术学报,2011, 19（3）：434-441.

［4] JJF 1006-1994.一级标准物质技术规范, 1994.

［5] Wu G, Wu Y, Nie S, et al. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1［J] . Food Chemistry, 2010, 119（1）：417-422.

［6] Jeong SC, Pack IS, Cho EY, et al. Molecular analysis and quantitative detection of a transgenic rice line expressing a bifunctional fusionTPSP［J].Food Control, 2007, 18（11）：1434-1442.

［7] 李亮, 王晶, 隋志伟, 等.转基因定量检测用质粒分子标准物质研究进展［J] .生物技术通报, 2012（2）：48-52.

［8] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines：Minimum information for publication of quantitative Real-time PCR experiments［J] . Clinical Chemistry, 2009, 55（4）：611-622.

［9] ISO Guide 35：2006. Reference materials-General and statistical principles for certification. International Organization for Standardization（ISO）, Geneva, 2006.