拟南芥PKS5 蛋白激酶在大肠杆菌中的克隆及表达

宋晓芸，马伟超

(天水师范学院 生命科学与化学学院，甘肃 天水741001)

0 引 言

在传统的高校分子生物学实验教学中［1］，学生单纯按照课本上的实验步骤进行实验操作，缺乏独立思考的过程。同时，由于各实验的独立性比较强，各实验间的联系性不强，学生进行的只是独立的实验，而缺少对实验的整体认识，没能形成整体的科研思路［2］。当前大多数院校开设的分子生物学实验中，经常需要用到DNA 分离纯化、PCR 扩增、割胶纯化、感受态细胞制备、连接、转化等基因克隆技术［3-4］，但大多实验间缺少衔接，这不仅不利于学生对分子实验的整体性掌握，也不利于培养学生严谨的实验精神。因此，针对这一现状，本文设计了一个在大肠杆菌中表达植物基因的综合实验，对高校分子生物学实验教学模式的改革提供了思路。

拟南芥是常用的植物模板生物，其基因组大约为12 500 万碱基对，且基因组已被测序。因此本试验选用拟南芥为克隆基因的来源。为了降低实验难度和保障实验的重复性，本试验选择了一个不含内含子的基因PKS5(Salt Overly Sensitive2-Like Protein Kinase5)蛋白激酶作为克隆目标。拟南芥PKS5 蛋白激酶是PKS家族成员之一，包含435 个氨基酸，它在拟南芥抗高pH 及盐碱中的信号转导的过程中起重要作用［5］。

1 材料和方法

1.1 菌株及质粒

含质粒的大肠杆菌菌株(pUC19/Escherichia. coli DH5α、pGEX-6P-1/Escherichia.coli BL21)。

pUC19 质粒及pGEX-6p-1 质粒均由本实验室保存。

1.2 菌株的培养与收集

将大肠杆菌接种到LB 平板上活化，37 ℃过夜培养。

从平板上挑取单菌落接种至液体LB 培养基中，37 ℃过夜扩大培养。

1.3 主要试剂

(1)CTAB，SDS，EDTA，D，L-2000marker，蛋白酶K，β-巯基乙醇，IPTG，SanPerp 柱式DNA 胶回收试剂盒(生工生物(上海)有限公司)，Protein MW Maker，T4DNA 连接酶，Taq 酶，BamHI、EcoRI 等酶(Takara 公司)。

(2)引物［6］。上游引物(PKS5GEXFBamHI):Cg g gAT CCA TgC CAg AgA TCg AgA TTg cc (BamHI 酶切位点)。下游引物(PKS5GEXFEcoRI):gg A ATT C TT AAA Tag CCg CgT TTg TTg(EcoRI 酶切位点)。引物由上海生工生物公司合成。

1.4 主要仪器

TGL-20M 型高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机有限公司)，Bio-Rad Gel2000 凝胶成像系统(美国biorad 公司)，DYY-4C 型电泳仪(北京市六一仪器厂)，电泳槽(北京市六一仪器厂)，金花牌移液器(北京青云卓立精密设备有限公司)，MG48 +型PCR 扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司)。

1.5 拟南芥基因组DNA 的提取方法(CTAB 法)

参照《精编分子生物学实验指南》中的方法［7］，用液氮将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到2 ml 离心管中;往粉碎的组织中加入预热的β-巯基乙醇/CTAB(4 g/ml)，混合使之充分湿润，于65 ℃温浴30 min，不时混匀;用等体积的氯仿/异戊醇(24 ∶1)抽提匀浆液，4 ℃，7 500 g 离心5 min，取上清;加入1/10 体积的65 ℃的CTAB/NaCl 抽提液，颠倒混匀;再用等体积的氯仿/异戊醇(24 ∶1)抽提，颠倒混匀，4 ℃，7 500 g 离心5 min，取上清;加入1/10 体积的CTAB 沉淀液，颠倒混匀，4 ℃，500 g 离心5 min;移除上清，用高盐TE 缓冲液重悬沉淀;加入0.6 倍体积的异丙醇，充分混匀，于4 ℃，7 500 g 离心15 min;用70%乙醇洗涤沉淀，常温干燥，溶解于TE 缓冲液中。0.8% 的琼脂糖凝胶电泳，电压80 V 的条件下电泳1 h，在凝胶成像仪上观察DNA 分子的大小、完整性及电泳条带的清晰度并拍照。

1.6 PCR 扩增PKS5 蛋白激酶基因方法

模板DNA 1 μl，10 ×PCR Buffer 5 μl，MgCl24 μl，dNTP 4 μl，上游引物、下游引物各2 μl，Taq 酶1 μl，加灭菌去离子水至总体积50 μl。扩增程序为:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，进行35 个循环，72 ℃后延伸10 min。反应结束后0.8% 的琼脂糖凝胶电泳，80 V，电泳1 h，通过凝胶成像系统观察条带大小、完整性及电泳条带的清晰度并拍照。随后回收PCR 产物。

1.7 提取pGEX-6P-1 质粒DNA 的方法(碱裂解法)

取1.5 ml pGEX-6P-1/BL21 转化子培养物加入2 ml 离心管中，室温8 000 r/min 离心2 min，弃上清;将细菌沉淀重悬于200 μl 预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，室温静置5 min;加400 μl 新鲜配制备的溶液Ⅱ，温和颠倒混匀2 ～5 次，冰浴5 min;加入300 μl 预冷的溶液Ⅲ，温和颠倒混匀，冰浴5 min;4 ℃下8 000 r/min 离心5 min，将上清液移至新的离心管中;加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1)，振荡混匀，12 000 r/min 离心5 min。取上层水相移至一新离心管中，加入0.6 倍体积异丙醇，混匀，室温下放置5 min，4 ℃12 000 r/min 离心15 min，弃上清;沉淀用70%乙醇漂洗1 次，4 ℃12 000 r/min 离心5 min。弃上清，室温干燥，沉淀溶于适量50 μL 灭菌去离子水(pH 8.0)中。用0.8% 的琼脂糖凝胶电泳，80 V，电泳1 h，在凝胶成像仪上观察质粒DNA 的大小、完整性及电泳条带的清晰度并拍照。

1.8 限制性核酸内切酶消化及重组质粒制备方法

将PCR 产物和pGEX-6P-1 质粒DNA 用BamHI 和EcoRI 双酶切，待反应结束后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测、拍照。电泳条带合适后，将PCR 产物6 μl，pGEX-6P-1 酶切质粒2μl，T4 DNA ligase buffer 1 μl，T4 DNA 连接酶1μl 充分混合，16 ℃下保温过夜，－4 ℃保存供后续实验使用。

1.9 感受态细胞制备方法(CaCl2 法)

参照大肠杆菌感受态细胞的制备和转化的方法［8］，本实验室加以改进，从LB 平板上挑取新活化的大肠杆菌BL21 单菌落，接种于5 ml 的LB 培养基中，37 ℃震荡过夜;取100 μl 培养液，转接于5 ml 的LB液体培养基中，37 ℃条件下振荡培养使A600达到0.5～0.6 左右;将培养液3 ml 移至Eppendorf 管中、冰浴20 min;4 ℃条件下，3 000 r/min 离心5 min，弃上清;将沉淀轻缓的悬于1 ml 冰冷的MgCl2(pH7.2)溶液中，按上步方法离心，弃上清;再将沉淀轻缓的悬于0.5 ml冰冷的含20%甘油的0.1 mol/L CaCl2(pH7.2)溶液中;冰浴20 ～30 min 后，4℃条件下，3 000 r/min离心5 min，弃上清;细胞沉淀用100 μl 冰冷的含20%甘油的0.1 mol/L CaCl2(pH 7.2)悬浮。冰浴放置，备用。

1.10 感受态细胞的转化

将重组质粒pGEX-6P-1/PKS5 DNA 加入100μl 感受态细胞中，吸打混匀;冰上放置30 min;将试管放入42℃水浴锅中热击1 min;将上述溶液移入盛有1 ml预热的(37 ℃)SOC 培养液的Eppendorf 管中，37 ℃振荡培养1 h;取50 μl 涂布于含Amp 的LB 平板上;37℃培养16 ～24 h，观察结果。

1.11 IPTG 诱导pGEX 重组子表达

按照Chaperone Competent Cell BL21 Series(Cat.#9120 ～9125 v0902)说明书介绍的方法，将含有pGEX-6p-1 重组子的BL21 菌落接种于2 ml 含Amp(100 μg/ ml)和氯霉素(2 μg/ ml)的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜，至A600达0.5(0.4 ～0.6)左右;加入四环素至终浓度10 ng/ml。继续培养至A600为0.6 时，15℃振荡培养30 min;取出1 ml 样品作为IPTG 诱导前的样品，－20 ℃保存;其余样品中加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，15℃振荡培养3 ～5 h;分别在l、2、3、4 h后取出1.0 ml 样品作为IPTG 诱导后的样品，－20 ℃保存;将IPTG 诱导前样品与诱导后的样品5 000 r/min离心5 min。分别回收菌体沉淀;沉淀样品中分别加入100 μl 2 ×样品缓冲液和100 μl 无菌水，在漩涡混合器上剧烈振荡，使菌体完全分散，将样品在沸水浴中保持10 min，立即放入冰浴中冷却;12 000 r/min离心2 min，回收上清液至一新的离心管中;取10 μl诱导前的对照样品与5 μl 诱导后的样品以及5 μl Protein MW Marker 上样，进行SDS-PAGE 分析［9］。

2 结果与分析

2.1 拟南芥基因组DNA 的提取结果

按照1.6 的制备方法，提取拟南芥基因组DNA，在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测:取样品10 μl，加2 μl 6 ×Loading Buffer，80 V 电泳1 h，电泳结束后，与凝胶成像系统成像，提取结果如图1 所示，拟南芥基因组DNA 大小在21 kb 左右。

2.2 PCR 扩增结果

以拟南芥基因组DNA 为模板进行扩增，电泳结果如图2 所示。大约在1.3 kb 处有一特异扩增条带，应该是PKS5 基因(PKS5 基因的实际大小为1 345 bp)，此外在100 ～200 bp 左右处有大量的非特异性扩增产物。

2.3 pGEX-6P-1 质粒DNA 的提取结果

以碱裂解法提取的pGEX-6p-1 质粒经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后如图3 所示。pGEX-6p-1 质粒大小在4.9 kb 左右，可以作为载体进行后续操作。

图1 拟南芥基因组DNA

图2 拟南芥基因组PCR 产物

图3 pGEX-6P-1 质粒DNA

2.4 限制性核酸内切酶消化结果

用BamHI 和EcoRI 双酶切PKS5 基因扩增产物及pGEX-6p-1 质粒。在37 ℃条件下反应2 h，然后用0.8%凝胶电泳，其结果如图4 所示。PKS5 基因扩增产物酶切后在1. 3 kb 处，pGEX-6p-1 质粒酶切后在4.9 kb 处。

2.5 SDS-PAGE 电泳结果

将pGEX-6p-1 质粒、PCR 扩增产物分别进行EcoRI 和BamHI 双酶切后，用T4 DNA 连接酶连接。将连接好的重组质粒转入E.coli BL21 中，经蓝白筛选挑选阳性克隆转化子在含Amp、氯霉素、Tet 的培养基进行培养;在培养中途加入诱导物IPTG 诱导细胞大量表达PKS5 蛋白激酶，然后进行SDS-PAGE 分析，结果如图5 所示。①为诱导1 h 样品的条带;②为诱导2 h 样品的条带;③为诱导3 h 样品的条带;④为诱导5 h样品的条带。IPTG 诱导时间越长，GST-PKS5 融合蛋白表达量越高。

图4 pGEX-6P-1 质粒DNA 酶切及PCR 产物酶切

图5 PKS5 蛋白激酶在E.coli 中的表达

3 结 语

本实验的试验规模较大，学生在实验过程中会同时进行实验设计和实验操作两部分的内容，这样就避免了按照传统教学模式中“照方抓药”［12］的情况的出现。

这个实验，不仅使学生学到了基本的实验操作技能，还培养他们提出问题，分析问题与解决问题的能力，让他们学会去举一反三，全方位多角度的去考虑问题。同时也使学生形成一个基本的科研思路，培养了他们独立思考的能力［13］。

同时，由于实验的整体性，在整个的实验过程中，一个环节的失误就会导致整个实验的失败，所以学生在实验的过程中定会更加认真和谨慎地进行实验操作，这样的实验教学设计有助于学生养成良好的实验习惯，形成严谨认真的科学态度。

另外，本实验仅涉及到PKS5蛋白激酶克隆与表达的部分内容，而对于本实验，还有很多可以扩展的内容，如:PKS5 蛋白激酶表达活性的测定［14］，蛋白质双向电泳western bolt［15］，拟南芥转基因植株的耐盐性分析［16］等。所以，本实验还有很大的拓展空间。学生可以根据自身的认知情况和学习兴趣，继续设计后续实验方案，并在此过程中逐步培养其探索精神。

［1］ 高利臣，肖 璐，冯 涛. 分子生物学实验教学改革的几点思考［J］. 实验室研究与探索，2010，29(4):99-102.

［2］ 胡位荣，王 进，汪 超，等. 生物学科综合性和设计性实验教学状况的调查分析［J］. 实验室研究与探索，2010，29(8):249-252.

［3］ 张以顺，黎 茵，陈云凤. 分子生物学实验的科研型教学模式探索与实践［J］. 实验室研究与探索，2010，29(8):238-240.

［4］ 何 钢，叶翠层，王义强，等. 分子生物学综合实验教学改革研究［J］. 实验室研究与探索，2006，25(11):1401-1404.

［5］ 秦云霞. PKS5 和互作分子伴侣DnaJ 在ABA 信号系统中的功能分析［D］. 海口:华南热带农业大学，2007.

［6］ YANG Y，QIN Y，XIE C，et al. The arabidopsis chaperone J3 regulates the plasma membrane H +-ATPasethrough interaction with the PKS5 kinase［J］. The Plant Cell，2010(22):1313-1332.

［7］ 奥斯伯F M，金斯顿R E，赛德曼J G，等. 精编分子生物学实验指南［M］. 4 版. 马学军，舒跃龙译. 北京:科学出版社，2005.

［8］ 安建平，王廷璞. 生物化学与分子生物学实验技术教程［M］.兰州:兰州大学出版社，2005.

［9］ 萨姆布鲁克J，拉塞尔D W. 分子克隆实验指南［M］. 3 版. 黄培堂译.北京:科学出版社，2002.

［10］ 李丽萍，彭少丹，杨艳琼，等. 分子生物学综合实验教学改革探索［J］. 实验科学与技术，2012，10(1):104-106.

［11］ 王莲哲，柳 静，杨海波. 基于培养学生创新能力的分子生物学实验改革探索［J］. 科技资讯，2010(3):148.

［12］ 吴俊明，骆红山，张洪祥，等. 科学教育基础［M］. 北京:科学出版社，2008.

［13］ 曲 波，李庆章，张 莉，等. 生物化学与分子生物学实验室开放的模式选择［J］. 实验室研究与探索，2010，29(7):315-317.

［14］ 童 煜，陈守春，张思仲. 纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定［J］. 应用与环境生物学报，2007，13(3):369-372.

［15］ 蒋佳宏，王 东，胡 源，等. 光照与温度对拟南芥tak 基因表达与LHC 磷酸化的影响［J］. 生物化学与生物物理进展，2009，36(9):1202-1207.

［16］ 唐亚雄，夏桂先，刘世贵. 拟南芥盐胁迫应答相关基因AtGRP9的克隆及表达［J］. 生物化学与生物物理学报，2002，34(6):737-747.