环磷酰胺对SD大鼠围产期的毒性影响

孙昌华 卜 文 李春令 任庆海 刘思当 （山东农业大学动物科技学院 泰安 271018）

环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)又名环磷氮芥，安道生、癌得星或癌得散，是一种氮芥类化合物，是一种临床上常用的免疫抑制和抗肿瘤药物[2]，但其毒副作用较强，尤其是具有较强的致畸、致突变作用，影响人体生殖细胞及胎儿的生长和发育，严重危害人类生殖健康。本文以环磷酰胺对SD大鼠Ⅲ段生殖毒性进行研究，探讨环磷酰胺对父母代(P代)母鼠妊娠期和哺乳期的体重、摄食量、药后反应及母鼠的妊娠率、死亡率、分娩情况和哺乳情况等指标。Ⅲ段生殖毒性试验是为了检测从着床到断乳这段时间给药对母体妊娠、哺乳以及胚胎和子代发育的不良影响。由于此阶段所造成的影响可能延迟，试验应持续观察至子代性成熟阶段。Ⅲ段生殖毒性具体表现为：妊娠动物对毒性的敏感性增加；在子代出生前后导致其死亡；子代生长发育的改变；子代的功能缺陷，包括行为、成熟和生殖[1]。F1代大鼠哺乳期内每窝的数量、体重、外观畸形、出生存活率、哺乳成活率、性别比例、身体发育指标和神经发育指标等。F1代雄鼠的生育率、雌鼠的妊娠率和孕鼠的摄食量、体重、窝重、卵巢重、黄体数、着床数、着床前丢失率、着床后丢失率及其仔鼠(F2代)的存活率、死胎率、吸收胎率等指标。同时，研究环磷酰胺对SD大鼠生殖毒性的量效关系，为环磷酰胺在临床上的合理应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 选择7～8周龄SPF级SD大鼠150只(♀100只，♂50只)；体重范围：♀160g～190g，♂180g～210g；购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 试剂环磷酰胺 购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号11081421。

1.1.3 主要仪器 穿梭实验视频分析系统，型号：ZHCSC，淮北正华生物仪器设备有限公司；五鼠通用转棒测试仪，型号：DigBehv-RRTR，上海吉量科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 妊娠动物处理 将雄鼠与雌鼠l:l合笼。通过每日早上检查阴道栓，发现阴道栓为受孕0天。P代每组准备22只孕鼠，如果最后1天有多余孕鼠则继续分配到各组中，F1代大鼠共交配2周。

1.2.2 动物分组 采用随机原则分组，将孕鼠分为4组，分别为溶媒对照组(Veh)、环磷酰胺低剂量组(L)、中剂量组(M)、高剂量组(H)每组P代孕鼠不少于20只。

1.2.3 给药方法 皮下注射给药(sc)[1,4]。给药剂量：低剂量组(L)10mg·kg-1，中剂量组(M)20mg·kg-1，高剂量组(H)40mg·kg-1[5,6]，溶媒对照组(Veh)给予氯化钠注射液，给药容积：5ml·kg-1。P代妊娠大鼠第15天和分娩后第1天、第6天、第12天、第18天各给药1次，共5次。

1.2.4 动物的处置 P代大鼠交配结束后，若孕鼠数量不够，则继续交配补足孕鼠数，若孕鼠分娩后达到所需数量，则剩余雌、雄大鼠CO2吸入法处死。P代雌鼠产仔后，检查每窝出生时活仔数、死仔数、畸形数、出生存活率和哺乳成活率、体重、身体发育、性成熟和生育力、感觉功能、反射和行为等。P代雌鼠产仔后，每窝的仔鼠数进行调整，每窝原则留4个雄性，4个雌性，尽量保持每个剂量组的雌雄仔鼠比例接近1:1，多余的仔鼠CO2处死。如果每窝中胎仔数少于8个，就不再调整。 P代哺乳雌鼠饲养其子代至21天离乳，每窝选择雌、雄子代(F1代)大鼠各1只，每组留雌雄大鼠(F1代)各20只，不足时，用同一剂量组其它窝的仔鼠补齐，饲养至成年，然后进行交配检测其生殖能力，其余F1代大鼠离乳后CO2处死。F1代交配结束后，雄鼠和未交配上的雌鼠全部CO2处死。哺乳雌鼠哺乳结束后用CO2处死并做大体尸检，F1代孕鼠妊娠15天时用CO2处死后做大体尸检并观察其胚胎发育情况等。

1.2.5 观察指标 按Ⅲ段生殖毒性常规实验方法，观察各试验组环磷酰胺对父母代(P代)母鼠妊娠期和哺乳期的体重、摄食量、药后反应及母鼠的妊娠率、死亡率、分娩情况和哺乳情况等指标。F1代大鼠哺乳期内每窝的数量、体重、外观畸形、出生存活率、哺乳成活率、性别比例、身体发育指标和神经发育指标等。F1代大鼠性成熟后，各剂量组雌雄大鼠1:1合笼交配，交配结束后，雄鼠安乐死，孕鼠继续饲养至妊娠15天剖检，检查F1代雄鼠的生育率、雌鼠的妊娠率和孕鼠的摄食量、体重、窝重、卵巢重、黄体数、着床数、着床前丢失率、着床后丢失率及其仔鼠(F2代)的存活率、死胎率、吸收胎率等指标。

1.2.6 数据处理 所有试验数据均采用SPSS19.0软件处理。

2 结果

2.1 一般状态观察和剖检观察

2.1.1 P代母鼠孕期无流产、早产和异常死亡动物 P代母鼠药后观察未出现明显毒副反应，哺乳期结束后剖检的母鼠大体尸解未见明显异常。L组P代孕鼠未见胎仔分娩，但剖检时发现有着床痕；H组孕鼠分娩后全部剖检，剖检未见明显异常。

2.1.2 F1代大鼠状态观察 F1代雌雄大鼠断乳后，Veh组和L组的一般状态观察未见明显异常。M组的一般状态观察发现全部大鼠牙齿畸形。F1代雌全部交配成功。

2.2 动物体重

2.2.1 P代孕鼠体重 由表1可知，P代孕鼠L和M组孕鼠的体重与Veh组比较，无明显差异(P>0.05)；H组孕鼠第21天的体重极明显低于Veh组(P<0.01)。

表1 P代孕鼠体重(均值±SD) （g）

2.2.2 P代母鼠哺乳期体重 由表2可知，P代哺乳母鼠：L组体重与Veh组比较，无明显差异(P>0.05)；M组第9天的体重显著低于Veh组(P<0.05)。

表2 P代母鼠哺乳期体重(均值±SD) (g)

2.2.3 P代仔鼠(F)代哺乳期体重 由表3可知，P代仔鼠(F1代)哺乳期：L组雄仔鼠第3、9、12、15和21天的体重显著或极显著低于Veh组(P<0.05或P<0.01)；M组雄仔鼠第0～21天的体重极显著低于Veh组(P<0.01)。L组雌仔鼠的体重与Veh组比较，无明显差异(P>0.05)；M组雌仔鼠第0～21天的体重极显著低于Veh组(P<0.01)。

表3 P代仔鼠(F1代)哺乳期体重(均值±SD) (g)

2.2.4 断奶后F1代雄鼠体重 由表4可知，F1代雄鼠：L组第3～12周的体重显著或极显著低于Veh组(P<0.05或P<0.01)；M组第0～12周的体重极显著低于Veh组(P<0.01)。

2.2.5 断乳后F1代雌鼠体重 由表5可知，F1代雌鼠：L组第5～8周的体重显著低于Veh组(P<0.05)；M组第0～12周的体重极显著低于Veh组(P<0.01)。

表4 断乳后F1代雄鼠体重(均值±SD) (g)

表5 断乳后F1代雌鼠体重(均值±SD) (g)

2.2.6 F1代孕鼠体重 由表6可知，F1代孕鼠：L组体重与Veh组比较差异不显著(P>0.05)；M组第0～15天的体重极显著低于Veh组(P<0.01)。

表6 F1代孕鼠体重(均值±SD) (g)

2.3 动物摄食量

2.3.1 P代孕鼠 L和M组孕鼠的摄食量与Veh组比较，无明显差异(P>0.05)；H组孕鼠第18天和第19天的摄食量极显著低于Veh组(P<0.01)。

2.3.2 P代哺乳母鼠 L组孕鼠第9、15天的摄食量显著或极显著低于Veh组(P<0.05或P<0.01)；M组孕鼠第3～15天的摄食量极显著低于Veh组(P<0.01)。

2.3.3 F1代雄鼠 L组雄鼠第5、6周的摄食量显著低于Veh组(P<0.05)；M组雄鼠第1～13周的摄食量极显著低于Veh组(P<0.01)。

2.3.4 F1代雌鼠 L组雌鼠的摄食量与Veh组比较，无明显差异；M组雌鼠第1～13周的摄食量极显著低于Veh组(P<0.01)。

2.3.5 F1代孕鼠 L组孕鼠的摄食量与Veh组比较，无明显差异；M组孕鼠第3～15天的摄食量极显著低于Veh组(P<0.01)。

2.4 P代母鼠妊娠率、孕鼠死亡率

Veh、L、M和H组P代母鼠妊娠率分别为：95.7%、95.5%、95.5%、100.0%；Veh、L、M和H组P代孕鼠死亡率均为0%，各给药组P代母鼠妊娠率、孕鼠死亡率与Veh组比较，无明显差异(P>0.05)。

2.5 P代活仔鼠(F1代)外观畸形率、出生存活率、哺乳成活率、身体发育和反射发育

（1）Veh、L和M组的仔鼠的外观畸形率分别为6.47%、10.32%和86.41%；Veh、L和M组的仔鼠的出生存活率分别为：98.06%、98.41%和49.51%；Veh、L和M组的仔鼠的哺乳成活率分别为：99.43%、100.00%和95.74%。（2）L组P代仔鼠(F1代)的外观畸形率、出生存活率和哺乳成活率与Veh组比较，无明显差异(P>0.05)；M组P代仔鼠(F1代)的哺乳成活率与Veh组比较，无明显差异(P> 0.05)；M组P代仔鼠(F1代)的外观畸形率极显著高于Veh组(P<0.01)；M组P代仔鼠(F1代)的出生存活率极显著低于Veh组(P<0.01)。（3）Veh组动物的身体发育指标和全部反射发育的时间都在正常范围内。L组动物包皮分离和断崖回避指标与Veh组比较显著延迟(P<0.05)；M组动物睁眼、腹毛生出、包皮分离、阴道张开、触须定位和视觉定位指标与Veh组比较显著或极显著提前或延迟(P<0.05或P<0.01)。（4）各给药组动物转棒试验结果和穿梭箱试验结果与Veh组比较，无明显差异(P>0.05)。

3 结论

本试验中SD大鼠给予溶媒和环磷酰胺低、中、高剂量后，各给药组对大鼠围产期都有毒性作用，其中H组毒性最强，F1代动物全部死亡；M组毒性明显，对P代雌鼠和F1代大鼠的各种指标几乎都产生了极强的毒性作用，特别是造成F1代大鼠的牙齿畸形；L组毒性较轻，对P代雌鼠和F1代大鼠的生长发育产生了较轻的毒性作用，且未造成F1代大鼠严重的畸形。

综上所述，环磷酰胺低、中、高剂量组均可见对SD大鼠围产期具有明显的毒性作用，并具有一定的量效关系。

[1]袁伯俊, 廖明阳, 李波. 药物毒理学实验方法与技术[M]. 北京化学工业出版社, 2007.

[2]王新禹, 梁前进. 环磷酰胺的毒副作用机制及应对作用措施[J].药学进展, 2006. 30(10): 452-456.

[3]《药物生殖毒性研究技术指导原则》课题研究组.药物生殖毒性研究技术指导原则. 北京: 2006.11.

[4]王新禹, 梁前进. 环磷酰胺的毒副作用机制及应对作用措施[J].药学进展, 2006.30(10): 452-456.

[5]袁伟杰, 黄洁波. 环磷酰胺对两性生殖系统毒性损伤的临床研究进展[J]. 中国中西医结合杂志. 2010.11(7): 568-570.