大鼠血管内皮细胞的分离、鉴定及传代培养

高瑞金 刘 学 崔卫波 谭海明 张碧成 陆倩倩 张雨梅

（扬州大学兽医学院 江苏 扬州 225009）

血管内皮细胞是铺陈于血管内壁的一层多功能细胞，在血管通透性屏障、免疫防御及炎性反应中起着极其重要的作用[1]。大量研究显示，血管内皮是许多心血管疾病或危险因子作用的重要靶器官，具有相当活跃的内分泌和代谢功能。血管内皮细胞具有多重的生物学特性，而大鼠是主要的实验动物，因此建立大鼠血管内皮细胞的体外培养方法对于研究内皮细胞特性、对作用于血管的药物及抗肿瘤药物的研究具有重要意义。本试验采用植块法分离大鼠血管内皮细胞，通过条件培养以及CD31免疫组化和管形成鉴定，建立了大鼠主动脉血管内皮细胞的体外培养方法。

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠，雄性，200g左右，扬州大学比较医学中心提供。人重组VEGF165，美国Prospec公司；HGDMEM和胎牛血清(FBS)，美国Gibco公司；兔抗大鼠CD31抗体，美国Santa Cruz公司；羊抗兔FITC荧光抗体，瑞士Roche公司；Matrigel基质胶，美国BD公司；Trypsin、Pen/ Strep/ Amphotericin B、戊巴比妥钠、肝素钠，生物工程(上海)有限公司；羊抗兔即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、Mayor，s苏木素均为武汉博士德生物工程有限公司产品；EDTA、氯化钠、氯化钾和磷酸二氢钾，天津科密欧化学试剂有限公司；多聚甲醛、甲醇、硫酸铜、碳酸氢钠和Na2HPO4·12H2O，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离与原代培养Wistar大鼠2%戊巴比妥钠麻醉后，经75%乙醇浸泡消毒后固定在手术板上，在超净工作台中打开胸腹腔，分离胸主动脉。取出胸主动脉，用PBS冲洗3～4次后，放入另一个无菌培养皿中，用眼科镊小心除去血管周围结缔组织及脂肪，纵行剖开血管，用眼科剪分割成2mm×2mm大小的血管块，将血管块内皮面向下贴于铺有明胶的50ml培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中静置2h后，加入适量含20%FBS、4ng/mlVEGF165和100μg/ml肝素的DMEM培养液培养[2-4]，液体仅遮盖主动脉即可。培养4d后，弃去主动脉植块，2～3d换液1次。

1.2.2 传代培养 原代细胞培养约12～14d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上时即可传代[3]。弃去培养液，用PBS冲洗培养瓶后，加0.25%胰蛋白酶消化3～5min，见内皮细胞收缩变圆，立即加入等体积的含胎牛血清的DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打并混匀，移入10ml离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM培养液适量制成细胞悬液，分至2个50ml培养瓶中。根据内皮细胞贴壁时间快于成纤维细胞，因此传代4h后换液以除去未贴壁杂细胞，以后隔天换液1次。

1.3 细胞鉴定

1.3.1 细胞形态 倒置显微镜下观察不同代次的细胞形态，是否呈现内皮细胞典型的折光性强、“铺路石”样等特点[3, 5]。

1.3.2 CD31免疫细胞分析 取2代细胞，制成细胞悬液后分于放有盖玻片的六孔板中，进行细胞爬片培养。待细胞融合至80%左右取出盖玻片，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗后滴加0.5%Triton-X100 10min；PBS清洗后加3%H2O220min，PBS再次清洗后加5%BSA封闭30min。滴加兔抗鼠CD31一抗4℃过夜，PBS代替一抗作阴性对照。第2天经PBS清洗后分别滴加羊抗兔二抗及羊抗兔FITC荧光二抗，进行DAB显色和荧光细胞分析。

1.3.3 内皮细胞的管形成 96孔板中先加入50μl基质胶于37℃培养箱中30min，后每孔加入1×104个第2代细胞悬液100μl，使细胞在基质胶表面均匀散开，置37℃、5%CO2培养箱中，培养2h后观察细胞形成的管状结构。

1.4 内皮细胞生长曲线

原代细胞及传代培养的细胞，调节细胞密度至2×105个/ml。24孔板每孔中加入细胞悬液100μl，含20%FBS的DMEM培养基900μl，于37℃、5%CO2培养。第2天开始，每天4孔连续计数6d，分别绘制2～6代细胞的生长曲线。

2 结果

2.1 内皮细胞分离及形态

主动脉块培养4d时，可见动脉块附近有原代内皮细胞迁出生长，细胞呈梭状或多角。培养12～14d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，可见血管内皮细胞的“铺路石”样特征，见图1。

图1 大鼠胸主动脉血管内皮细胞(×100)

2.2 CD31免疫细胞分析

CD31抗体免疫细胞化学（1）SABC显色，可见胞浆中淡黄棕色阳性细胞[6]；（2）FITC荧光二抗分析，可见胞浆中绿色荧光强阳性细胞，见图2。

图2 大鼠胸主动脉血管内皮细胞CD31免疫化学(×200)

2.3 内皮细胞管形成

从大鼠胸主动脉分离的原代内皮细胞及传代培养细胞，在Matrigel基质胶中培养2h后，均可见形成部分管状结构；至培养6h可见形成完整的血管样小管。

2.4 内皮细胞传代培养生长曲线

大鼠胸主动脉血管内皮细胞进行了六代传代培养，不同代次细胞形态上无变化，细胞生长曲线见图4。细胞于分瓶后4天至对数生长期，在相同培养时间不同代次细胞数无明显差异(P>0.05）。

图3 大鼠胸主动脉血管内皮细胞管形成(×50)

图4 内皮细胞生长曲线

3 讨论

内皮细胞的获取方法主要包括机械刮取法、酶消化法和植块法[7]。大鼠主动脉管腔较细酶消化法操作难度较大，获取内皮细胞数量较少，而机械刮取法获得的内皮细胞掺杂较多的杂细胞，本研究采用植块法获取的内皮细胞数量多，通过培养基中添加VEGF细胞因子、肝素等物质可以促进内皮细胞生长为优势细胞，从而保证了内皮细胞的纯度；而传代过程中采用的差速消化法，内皮细胞脱壁时间早于成纤维细胞，在内皮细胞脱壁时成纤维细胞仍处于贴壁状态，可以进一步除去杂细胞，获得纯度较高的内皮细胞。

血管内皮细胞的标记物有第Ⅷ因子、CD31、vWF、CD34、VEGFR和Weibel-Palade小体等[8-10]。CD31作为成熟内皮细胞表面分子标志物之一，近年来较多的被用于内皮细胞的的鉴定。本试验采用CD31免疫SABC组化及免疫荧光抗体分析对内皮细胞进行鉴定，内皮细胞阳性率较高，管形成试验也进一步验证了分离培养的内皮细胞的特性。

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