葛花鸢尾苷的酸水解及其对乙醇脱氢酶激活作用的研究

胡玉涛，马双双，刘 莹，王 益，黄 文*

1江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，连云港 222006;2华中农业大学食品科学技术学院，武汉 430070

葛花异黄酮是葛花生长过程中形成的一类次生代谢产物，具有解酒保肝［1，2］、抗肿瘤［3］、抗炎［4］、抗氧化［5，6］、保护胃粘膜等生物活性。葛花异黄酮大部分以糖苷形式存在，研究发现，游离型苷元的活性大大优于结合型的糖苷［2］。鸢尾苷在葛花中的含量较高，是葛花异黄酮的代表性成分［7］，糖苷键的存在妨碍了其活性的发挥。异黄酮糖苷转化为异黄酮苷元的方法主要有酸水解法、碱水解法、酶水解法、Smith降解等方法［8］。鸢尾苷为含碳-氧的葡萄糖衍生物，在酸性水溶液中较易水解，酸解过程如图1所示，酸解反应体系简单，产物易于分离，利于鸢尾苷元的纯化。本研究以葛花中鸢尾苷为反应底物，通过单因素和正交试验确定其酸水解的工艺条件，并分析鸢尾苷、鸢尾苷元体外对乙醇脱氢酶(ADH)的抑制效果，为葛花异黄酮水解工艺的研究和得到高活性的鸢尾苷元提供理论基础。

图1 鸢尾苷元的酸水解反应［(A)鸢尾苷;(B)鸢尾苷元］Fig.1 Acid hydrolysis of tectoridin(A)to produce tectorigenin(B)

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛花:采于湖北恩施，经江苏联合职业技术学院连云港中医药分院鉴定为豆科植物野葛［Pueraria lobata(Willd.)Ohwi］的干燥花蕾。晾干、粉碎成60目，密封置阴凉处保存;葛根素标品(含量大于99%)购于中国药品生物制品检定所;乙醇脱氢酶(ADH)购于Sigma Chemical Co(Germany)。

1.2 仪器与设备

Seven easy型pH计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司;高效液相色谱仪，日本岛津公司;RE-2000A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 鸢尾苷的制备工艺［9］

取葛花100 g置于三颈瓶中，加入溶剂1∶1(v/v)n-正丁醇相/水1000 mL，在浸取温度为70°C的条件下回流提取1.5 h。浸取液过滤后静置平衡，分出正丁醇相。将过滤得到的正丁醇相用旋转蒸发仪浓缩到100 mL，浓缩相在室温下放置12 h，得到异黄酮的冷却结晶，过滤干燥得粗产品。干燥的粗产品采用甲醇重结晶，得到粗产品的晶体。自然晾干，待用。

1.3.2 鸢尾苷的酸水解工艺

准确称取5 mg鸢尾苷晶体，加入密闭避光的水解管中，加入一定量的甲醇和盐酸溶液，超声处理10 min，充分混合均匀后于恒温水浴锅中水解。

1.3.3 鸢尾苷元的精制

按照1.3.2方法反应结束后，将反应后的水解液进行减压浓缩回收甲醇，冷却，水解液用乙酸乙酯萃取两次，蒸馏水水洗乙酸乙酯萃取液至pH检测为中性，无水硫酸钠脱水，回收乙酸乙酯，甲醇重结晶，得淡黄色针状的鸢尾苷元结晶，备用。

1.3.4 鸢尾苷水解率的测定

1.3.4.1 HPLC 检测条件

色谱柱:Hypersil BDS(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇-水(40∶60);检测波长:265 nm;流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。

1.3.4.2 鸢尾苷标准曲线的制作

准确称取在60℃真空干燥至恒重的鸢尾苷对照品2.4 mg，置10 mL容量瓶中，70%乙醇溶解并定容至10 mL，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，作为对照品溶液(每1 mL含鸢尾苷0.24 mg)。以2、4、6、8、10 μL 依次进样，测定峰面积，以峰面积(μv*s)为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=(5E+06)X+355733，R2=1。

1.3.4.3 鸢尾苷水解率的测定

将水解液用70%的乙醇定容至25 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤后待测。

A1:水解后鸢尾苷含量;A2:水解前鸢尾苷含量。

1.3.5 鸢尾苷、鸢尾苷元对乙醇脱氢酶(ADH)的激活作用

将1.5 mL 32 mM的焦磷酸钠缓冲液(pH 8.8)，1.0 mL 27 mM NADH 溶液，0.5 mL 11.5%(v/v)乙醇，0.1 mL 0.1 mg/mL 葛花异黄酮溶液混匀，25 ℃温育5 min 后，加入0.1 mL ADH(0.64 μg/mL)明胶溶液。对照组用0.1 mL蒸馏水代替葛花异黄酮溶液，其余操作相同。立即在340 nm波长下，每隔10 s读数一次，连续测定5 min。取NADH浓度曲线的线性部分来计算NADH生成量。

式中:V为总反应液的体积(mL);DF为稀释倍数;6.22为NADH在340 nm波长下的毫摩尔消光系数;0.1为酶液的体积(mL)。

2 结果与分析

酸水解反应主要受到酸水解温度、酸水解时间、盐酸浓度、固液比、甲醇浓度等因素的影响，本实验分别分析了不同因素对鸢尾苷水解效果的影响。

2.1 酸水解温度对鸢尾苷水解率的影响

测定在不同酸水解温度(50、60、70、80、90 ℃)条件下鸢尾苷水解率的变化，其结果如图2所示。

图2 不同酸解温度对水解率的影响Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis rate

由图2可知，温度对鸢尾苷水解率的影响十分显著，其水解率随着水解温度的增加逐步提高。当温度较低时(50、60℃)，鸢尾苷的水解率＜20%;当温度为70℃时，约有50%以上的鸢尾苷发生了水解;当温度达到80℃时，大部分的鸢尾苷都水解为鸢尾苷元(90% ＜水解率≤100%)。因此选择80℃为最佳温度。

2.2 酸水解时间对鸢尾苷水解率的影响

本文测定了在不同酸水解时间(3、4、5、6、7 h)条件下鸢尾苷水解率的变化，其结果如图3所示。

图3 不同酸水解时间对水解率的影响Fig.3 Effect of time on hydrolysis rate

由图3可知，在2 h到4 h之间，反应时间对水解率的影响较为显著，鸢尾苷的水解率随反应时间的延长而呈上升趋势。水解4 h后，反应时间的延长对水解率的影响不再明显，水解率曲线趋向平缓，鸢尾苷已经基本水解完全，出于成本和安全性考虑，选择4 h为最佳水解时间。

2.3 盐酸浓度对鸢尾苷水解率的影响

本文测定了在不同盐酸浓度(3%、4%、5%、6%、7%)条件下鸢尾苷水解率的变化，结果如图4所示。

图4 不同盐酸浓度对水解率的影响Fig.4 Effect of concentration of hydrochloric acid on hydrolysis rate

由图4可知，随着盐酸浓度的增加，鸢尾苷的水解率逐渐增大。当盐酸浓度增加到5%时，鸢尾苷水解率为72.77%，之后水解率的增加不再明显，由此判断5%为最佳盐酸浓度。

2.4 甲醇浓度对鸢尾苷水解率的影响

本文测定了在不同甲醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%)条件下鸢尾苷水解率的变化，结果如图5所示。

图5 不同甲醇浓度对水解率的影响Fig.5 Effect of concentration of methanol on hydrolysis rate

由图5可知，随着甲醇浓度的升高，鸢尾苷水解率逐渐下降，推断原因可能是由于在固液比一定的情况下，甲醇浓度越高，则盐酸含量越少，二者相互制约，而盐酸含量为主要影响因素，所以水解率越低。鉴于此，在单因素实验时考虑不把甲醇浓度的选择包括在内，而在正交优化时固定甲醇浓度考虑盐酸浓度对水解效果的影响。

2.5 固液比对鸢尾苷水解率的影响

本文测定了在不同固液比(mg:mL)(2∶1、4∶5、1∶1、4∶3、1∶2)条件下鸢尾苷水解率的变化，结果如图6所示。

图6 不同固液比对水解率的影响Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on hydrolysis rate

由图6可知，改变固液比对鸢尾苷水解率的影响不大，从提高产率和节约成本的角度出发，选择2∶1作为固液比。

2.6 鸢尾苷酸水解最佳工艺优化

为了进一步确定反应的最优条件以及影响因素的主次，选取酸解温度、酸解时间和盐酸浓度三个因素进行三因素四水平的正交试验来优化。正交试验因素水平和结果分别如表1和表2所示。

表1 酸解正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for acid hydrolysis

表2 酸解正交试验结果Table 2 Test designs and results for acid hydrolysis

以鸢尾苷水解率为指标进行极差分析(表2)可知，影响鸢尾苷酸解效率因素的主次顺序为:A(温度)＞B(时间)＞C(盐酸浓度)。从实验结果可以看出，当温度较低时，延长水解时间，增加盐酸浓度都会提高水解效率。但当温度较高时，延长时间，增加盐酸浓度易导致苷元分解，失去活性。故优化后确定酸解条件为A3B4C2，即温度80℃，酸解5 h，盐酸浓度4%，此时，鸢尾苷水解完全。

2.7 鸢尾苷酸水解前后的HPLC图谱分析

将酸水解反应前后的水溶液分别用70%的乙醇定容至25 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤后，进样10 μL检测酸水解前后鸢尾苷HPLC图谱的变化，结果如图7所示。

图7 酸解前后鸢尾苷的HPLC图谱［(a):酸解前;(b):酸解后］Fig.7 HPLC chromatograms of tectoridin before(a)and after(b)acid hydrolysis

图7(a)和(b)分别是水解前鸢尾苷和水解后产物的HPLC图谱，鸢尾苷的保留时间在6 min左右，鸢尾苷元的保留时间在25 min左右。由图(a)和图(b)可以看出，酸水解前，样品中以鸢尾苷为主要成分。在酸解反应结束后，鸢尾苷的峰几乎消失，出现鸢尾苷元的峰，并且鸢尾苷元为主要物质。对比图7(a)、(b)以及文献报道，可以确定鸢尾苷已被酸水解生成鸢尾苷元，水解率可达99%以上。

2.8 鸢尾苷、鸢尾苷元对乙醇脱氢酶的激活作用

人体内的乙醇脱氢酶活性越大，血液中的乙醇含量越低，进而起到解酒护肝的功效。分别测定鸢尾苷和鸢尾苷元晶体对乙醇脱氢酶的激活率，其结果如表3所示。

由表3可知，鸢尾苷、鸢尾苷元均表现出一定的对乙醇脱氢酶的激活作用，并且鸢尾苷元对乙醇脱氢酶的激活作用大于鸢尾苷。

3 结论

本文以从葛花中分离得到的异黄酮类化合物鸢尾苷单体为反应底物经酸水解反应得到鸢尾苷元，

表3 鸢尾苷、鸢尾苷元对ADH的体外激活作用Table 3 Effect of tectoridin and tectorigenin on ADH in vitro

通过单因素和正交试验，确定最佳反应条件为:固液比1∶1(mg:mL)，甲醇浓度50%，反应温度80℃，反应时间5 h，盐酸浓度4%，该条件下鸢尾苷可以完全水解，水解后得到的鸢尾苷元纯度为91.63%，产率为99.16%。通过对乙醇脱氢酶的激活作用实验，确定鸢尾苷元的激活率(132.35%)大于鸢尾苷(127.35%)，表明酸解可以提高葛花异黄酮类物质的生物利用率，提高一直以来作为废弃物处理的葛花的利用价值。

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