颗粒型和整体化色谱柱分析络石藤指纹图谱

熊野娟 ，周淑琴 ，范松华 ，姚 虹

(1.上海医药高等专科学校，上海 201318； 2.上海市医药学校，上海 200135)

络石藤为夹竹桃科植物络石 Trachelospermum jasminoides(Lindl.)Lem.的干燥带叶藤茎。2010年之前的《中国药典》收载于附录中，2010年版《中国药典(一部)》正式收载于正文中[1]，并制定了以络石苷的含量测定项，但未收载其指纹图谱／特征图谱的质控项目。文献[2]报道了络石藤的指纹图谱分析，并以去甲络石苷等多个化学对照品为参比成分，对14批药材进行了对比，发现不同产地的药材可能存在差异。高效液相色谱法生成的指纹图谱具有分辨率高、信息量大、方法稳定可靠的特点，在中药材质控中占有重要的地位。但是，一份样品的分析时间通常需要至少60 min，不利于大批量样品的快速鉴定。笔者在之前的研究中发现，在中药材指纹图谱分析中使用整体化色谱柱可以缩短分析时间。在本项研究中，建立不同色谱柱的分析方法，并进行了对比。

1 仪器与试药

Mettler Toledo AB265－S型电子天平；KQ－700VDV型超声波清洗机；TGL－16G型高速离心机；Waters 2695型液相色谱仪，包括Alliance 2695分离单元、2998二极管阵列检测器和EmpowerⅡ工作站；Agilent1200型高效液相色谱仪，包括G1311A四元梯度泵、G1322A脱气机、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱、G1314B紫外检测器和 Chemstation B.03工作站。常规色谱柱为Zorbax Eclipse plus C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm，Agilent 959990－902)，整体化色谱柱为 Chromolith Performance RP－18e柱(100 mm ×4.6 mm，Merck 1.02129)。药材和饮片均为从市场采购，并经上海市食品药品检验所鉴定为夹竹桃科植物络石 Trachelospermum jasminoides(Lindl.)Lem.的干燥带叶藤茎，详细情况见表1。络石苷对照品由中国医学科学院中药研究所刘安博士惠赠，高效液相色谱归一化纯度大于99%。

表1 样品来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件选择

研究发现，尽管采用乙腈为有机相可以得到尖锐的峰形，但洗脱色谱峰的个数比采用甲醇时少，意味着某些成分未能分离；此外，在水相中加入磷酸或醋酸后，对洗脱峰的数量、峰形和峰的分离度没有明显的影响，因此选择甲醇－水梯度洗脱为流动相。

系统A采用常规的颗粒型填料色谱柱(Eclipse plusC18柱)，并经优化设定如下的梯度系统程序：0～60min，甲醇 17% ～55%，60～80 min，甲醇 55% ～90%。系统B采用整体化色谱柱(Chromolith RP－18e柱)，设定梯度系统程序如下：0～1 min，甲醇 5%，1～3 min，甲醇 5% ～20%，3～18 min，甲醇 20% ～35% ，18～26 min，甲醇35%～90%。

采用二极管阵列检测器记录络石苷对照品主峰的紫外吸收光谱，在220 nm和280 nm处有最大吸收。对比220，254和280 nm下采集的同一药材样品色谱图，见图1，220 nm和280 nm下色谱峰的强度最高，但220 nm下基线的飘移也更显著，因此选择280 nm为检测波长。

为了保证系统的重现性，均设定30℃的柱温。

图1 同一样品溶液不同检测波长下的色谱图(系统A，自上至下分别为254 nm、220 nm和280 nm)

2.2 溶液制备

参照药典，将药材和饮品适当粉碎，精密称取5 g，置三角瓶中，精密加入甲醇25m L，精密称定质量；超声(250W)30min；具塞静置过夜后再次超声(250W)30min；冷却至室温后再次精密称定质量，补足减失的甲醇，摇匀。16000r／min离心15min，取上清液1 mL，加水0.5 m L，混匀，作为样品溶液。精密称取络石苷对照品0.500 g，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。

2.3 不同系统建立的指纹图谱

系统A在60min内完成指纹图谱的分析(除溶剂峰外)，在样品中共标记了15个共有峰，其中，7号峰(保留时间约为35.2min)为参比物质络石苷峰。系统A的色谱图见图2，图中用数字标注出了共有峰。

图2 系统A中空白溶剂(上)、络石苷对照品溶液(中)和典型样品(下)的色谱图

采用整体化色谱柱的系统B在25 min内完成指纹图谱的分析(包括分析后的再次平衡)，在样品中共标记了14个共有峰，其中，6号峰(保留时间约为13.7 min)为参比物质络石苷峰。系统B的色谱图见图3，图中用数字标注出了共有峰。

图3 系统B中空白溶剂(上)、络石苷对照品溶液(中)和典型样品(下)的色谱图

在两个系统下，空白溶剂对样品的测定均无干扰，样品中参比峰(络石苷)的确认分别经过了对照品和紫外吸收光谱的验证。

从两个系统所得的色谱图可以看出，颗粒型填料色谱柱具有更好的分离度，而整体化色谱柱则具有较快的分析时间。整体化色谱柱对参比峰及其后洗脱的两个小峰分离欠佳，除此之外，两个系统得到的色谱图类型相近。各共有峰的相对保留时间也非常接近。

2.4 精密度、重现性和稳定性考察

取0号样品制备一份样品溶液，连续进样6次，记录共有峰与参比峰的保留时间和各共有峰的相对峰面积峰面积。两个系统中，保留时间的差异均在2.0%以内；共有峰相对峰面积的差异均小于3.0%。取0号样品制备6份样品溶液，分别进样，记录共有峰与参比峰的保留时间和各共有峰的相对峰面积峰面积。两个系统中，保留时间的差异均在2.0%以内；共有峰相对峰面积的差异均小于3.0%。取0号样品溶液，室温下放置36 h，分别在第6，12，24，36 h在系统 A中进样测定，所得图谱中，各色谱峰的保留时间、相对峰面积均无明显差异，显示样品溶液可以稳定储存36 h。

2.6 样品的分析结果

两个系统下，1号样品均只有1个较明显的色谱峰，峰面积不到其他样品总峰面积的10%，推测为经过提取后的伪品。按照中国药典络石藤项下进行的鉴别实验也呈阴性反应。其余9份样品在两个系统中的色谱图分别见图4和图5。两个系统下共有峰相对保留时间的数据分别见表1和表2、相对峰面积的数据分别见表3和表4(1号样品因属伪品，未提供图谱和数据)。

图4 9批样品在系统A中所得到的色谱图

图5 9批样品在系统B中所得到的色谱图

从所得数据可以看出，9批样品在两个系统中均显示相近的色谱图，两个系统的差异主要在于分离度和保留时间，而主要色谱峰的相对保留时间非常接近。

不同样品之间，几个主要色谱峰的相对峰面积差异较大，如在系统 A中的 13号峰(保留时间 46.8 min，相对保留时间1.37)，与参比峰的相对峰面积最小值为 0.9，最高值超过 3.3；相应的，在系统 B中，对应的12号峰(保留时间19.3min，相对保留时间1.45)也呈现相同的趋势。根据文献[2]所附色谱图和色谱条件推测，该峰可能系络石苷水解后的络石苷元。特别的，4份饮片样品中该峰的相对峰面积在2～3，而5份药材样品则均低于1.5。这可能系络石藤药材在炮制过程中，部分络石苷会水解转化为络石苷元而导致的。

表1 系统A中共有峰的相对保留时间

表2 系统B中共有峰的相对保留时间

表3 系统A中共有峰的相对峰面积

表4 系统B中共有峰的相对峰面积

3 讨论

在两种色谱柱上分别建立了针对络石藤的指纹图谱分析方法，采用相同的流动相、不同的梯度洗脱方式，紫外280 nm检测，所得结果可以区分样品间的差异。

在Eclipse plus C18柱上可以得到更多的共有峰，可以用于络石藤药材指纹图谱的分析和各化学成分的含量测定，同时，分离度也优于Chromolith RP－18e柱；但后者的分析时间只需要20min，考虑到色谱柱平衡的时间很短，采用整体化色谱柱的分析时间缩短为颗粒型色谱柱的1／4～1／3，适合于样品的快速鉴别和短期内大量样品的批量分析。

在10批药材中，采自广东的1号药材异常，体现为色谱图中只有一个较小的色谱峰，且未与任何共有峰对应，应属经过提取的伪品，一些文献[3－5]中也提到了在不同的地区，络石藤药材的习用植物有较大差异。

在之前的研究中，整体柱在甘草和丹参药材指纹图谱分析中均具有比颗粒型色谱柱更好的分辨率、在大黄药材的研究中分离效果与传统商品柱相当，而本次对络石藤的结果恰恰相反。值得注意的是，整体柱取得较好结果的情形均是在使用乙腈作为有机相时出现的；而在络石藤和之前大黄药材的指纹图谱分析中，有机相为甲醇。这可能意味着对于整体化色谱柱，由于其物理结构和生产方式的差异，不同类型的溶剂(是否质子化溶剂、介电常数、黏度)可能具有不同的选择性。实际上，在络石藤药材早期的研究中，由于使用乙腈作为有机相，整体柱的确得到比颗粒型色谱柱更好的分离效果。

在实际样品的测定中可以发现，络石苷和推测为络石苷元这两个色谱峰占总峰面积的近50%，这两个峰的相对峰面积差异极大，因而对指纹图谱的相似性具有重要的影响。虽然4批饮片均为后一个峰的峰面积是络石苷峰的2倍以上、而5批药材中两个峰的峰面积比在1.5倍以下，但考虑到样品批次较少，仍需要进一步的研究以判断这种差异是否来自于药材炮制过程中因络石苷发生水解而导致的。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010:252－253.

[2]刘义全，于能江，杨学东，等.络石藤高效液相色谱指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2009，34(6):727 －730.

[3]章乐建.络石藤与薜荔的异同[J].海峡药学，2011，23(5)：54－55.

[4]谢洁行，王子薇，刘艳骄.络石藤常见混淆品紫外荧光的鉴别方法[J].吉林中医药，1997(5):37.

[5]来平凡，范春雷，李爱平.夹竹桃科络石与桑科薜荔抗炎镇痛作用比较[J].中医药学刊，2003，21(1):154 －155.