反相高效液相色谱法同时测定清热化毒丸中黄芩苷和汉黄芩素含量

刘 汇，赵 晶，李 琨

（1.吉林省延边朝鲜族自治州食品药品检验所，吉林 延吉 133000; 2.吉林省通化东宝药业股份有限公司，吉林 通化 134123； 3.吉林省延边朝鲜族自治州工业和信息化局，吉林 延吉 133000）

清热化毒丸是由黄芩、连翘、青黛、黄连等15味中药加工而成的中成药制剂，具有清火化毒、消肿止痛的功效。有关清热化毒丸质量控制都是采用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中单一成分，没有同时测定制剂中多种成分的含量。本试验中采用HPLC法同时测定制剂中黄芩苷和汉黄芩素两种成分的含量，以寻求建立同时测定制剂中多种成分来控制制剂质量的方法，可为控制清热化毒丸质量标准评价方法提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(四元泵，DAD检测器，自动进样器)，十万分之一天平（赛多利斯）。色谱甲醇（天津市科密欧化学试剂开发中心），甲醇为分析纯（北京化工厂），水为娃哈哈纯净水，磷酸为优级纯（北京化工厂）；黄芩苷对照品（批号为110715－200514），汉黄芩素对照品（批号为 1514－200001），均购于中国药品生物制品检定所；清热化毒丸（北京同仁堂药业股份有限公司，批号分别为 9013142，9013006，0013010）。

2 方法与结果[1]

2.1 色谱条件

色谱柱为 Waters SunFire C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇（A）－0.4% 磷酸溶液（B），梯度洗脱，[0～9 min，A：45%(体积分数，下同)；9～25min，A：45% →55% ；25 ～36，A：55%]，流速为 1.0mL ／min，检测波长 278 nm，柱温 35 ℃ 。

2.2 溶液制备

精密称取黄芩苷对照品和汉黄芩素对照品适量，加70%甲醇制成每 1 m L含黄芩苷 84μg、含汉黄芩素13.6μg的混合溶液，即得对照品溶液。取本品10丸，剪碎，取约1.0 g，精密称定，置 50 m L量瓶中，加入70%甲醇 40 m L，浸泡 20 min，超声处理40 min，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按清热化毒丸制备工艺，取缺黄芩药材的其余各味药，制成阴性样品，取该阴性样品按2.3项下方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μL，按2.1项下的色谱条件，注入液相色谱仪，结果显示供试品与对照品溶液均在相同保留时间内出现吸收峰，黄芩苷峰和汉黄芩素峰保留时间分别为9.9，32.9 min，理论板数分别大于6 000和30 000，阴性对照样品溶液在黄芩苷峰和汉黄芩素峰相应位置处无吸收峰，本测定无干扰，见图1。

线性关系考察：精密称取黄芩苷对照品和汉黄芩素对照品适量，置50 mL量瓶中，加70%甲醇制成每1mL含黄芩苷84μg，含汉黄芩素13.6μg的对照品贮备液，再用70%甲醇稀释成系列对照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，以对照品进样量（μg）为横坐标，经线性回归，得回归方程，黄芩苷为 Y＝2 709.2X ＋20.09，r＝0.999 9；汉黄芩素为 Y＝5 064X ＋4.5，r＝0.999 9，结果表明，黄芩苷和汉黄芩素进样量分别在 0.168～0.840 μg和 0.027～0.136 μg范围内与相应峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取上述黄芩苷和汉黄芩素对照品溶液10μL，按上述色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，计算 RSD分别为0.9%和1.1%，说明该方法具有良好的精密度。

稳定性试验：取同一批号样品，按供试品溶液的制备方法操作，分别于 0，1，2，3，4，5，6 h 精密吸取 10 μL 进样，测得黄芩苷和汉黄芩素峰面积的 RSD分别为0.9%和1.3%。结果表明，样品至少在6 h内稳定。

重复性试验：取同一批号样品6份，按供试品溶液的制备方法操作，分别制备供试液，测得黄芩苷和汉黄芩素平均含量分别为 0.236%和 0.046%，RSD分别为 1.0%和 1.1%。结果表明，该试验重复性良好。

加样回收试验：采用加样回收法，取已知含量的样品，精密称定，分别精密加入一定量的黄芩苷和汉黄芩素对照品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按上述测定方法进行测定，计算回收率，结果见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取3批样品，按照上述含量测定方法测定，测定结果见表2。

表2 3批样品含量测定

3 讨论

经紫外－可见分光光度计在200～400 nm对黄芩苷和汉黄芩素进行全程扫描得到光谱图显示，黄芩苷在280 nm和315 nm有最大吸收峰，汉黄芩素在278 nm有最大吸收峰，综合考虑，在278 nm处测定含量基线平稳，可以兼顾黄芩苷最大吸收波长，并均达到基线分离，故确定本文检测波长为278 nm。

本文对多种流动相进行了考察，分别比较了甲醇－水、乙腈－水等不同的流动相系统，并加入磷酸为改性剂。结果以甲醇－水为流动相，以0.4%磷酸为改性剂，梯度洗脱，各成分峰形较好，分离度高[2]。

对3批不同批次的样品黄芩苷和汉黄芩素含量进行了测定，结果3批样品平均含量相当，可作为该制剂的质量控制标准。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：282.

[2]高晓燕，卢建秋.栀子金花丸中栀子苷、黄芩苷、番泻苷A和番泻苷B的含量测定方法研究[J].中国中药杂志，2009，34（20）：2 649 － 2 651.