D-半乳糖对大鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响

颜冰希 ，余姗姗，冯 晓，吴冬玲，蔡昕筱，周倩沁，何晓敏，陈爱嫩，张大勇

(1.浙江大学城市学院医学院，浙江 杭州 310015;2.杭州市第二人民医院，浙江 杭州 310015)

干细胞具有自我更新及多向分化能力，对机体稳态的维持和器官损伤的修复具有重要作用［1］。但干细胞和体内其他细胞一样，也会衰老，衰老干细胞增殖及分化能力减弱［2-3］。MSCs(mesenchymal stem cells，MSCs)可分化为中胚层的各种细胞且经诱导能向神经外胚层分化，是临床细胞移植重要的种子细胞来源［4-5］，但MSCs 也存在衰老现象，老年MSCs 移植治疗效果不佳，延缓MSCs 衰老是其研究热点之一［6-7］。我们前期研究提示，老年MSCs 数量少，活力低，体外培养困难［8］，因此，构建稳定的MSCs 衰老模型，体外模拟MSCs 衰老对MSCs 衰老研究具有重要意义。D-半乳糖(Dgalactose，D-gal)是一种生理性营养成分，在细胞内通过醛糖还原酶的代谢可转化为半乳糖醇，半乳糖醇不能在细胞内代谢，产生后即在细胞内堆积，提高细胞氧化应激压力［9］。研究表明，D-gal 在动物模型(大鼠、小鼠和果蝇)上具有显著的致衰老作用，而且有复制方法简单、耗时短等优点，已作为致老剂被广泛应用［10-12］。但D-gal 对干细胞衰老的研究还较少，尤其是其对干细胞衰老的影响机制尚不清楚，这些均限制了D-gal 在干细胞衰老研究领域中的应用。本试验采用不同浓度D-gal 培养MSCs，观察其对MSCs 衰老、增殖、存活和氧化应激水平的影响，探讨不同浓度D-gal 诱导MSCs 衰老过程的作用及其机理，以期明确体外构建MSCs衰老实验模型的最适D-gal 浓度，为探讨干细胞衰老提供重要的实验数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 7 日龄Spragus Dawley(SD)乳鼠由浙江省医学科学院提供(动物合格证号:SCXK(浙)2008-0033)。

1.2 主要试剂 DMEM(美国Hyclone 公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程有限公司)，PBS 液，HBSS 液(美国Hyclone 公司)，胰蛋白酶(美国Hyclone 公司)，β-半乳糖苷酶检测试剂盒(南通碧云天生物技术有限公司)，AO/EB 染色液(南京凯基生物技术公司)，黄嘌呤氧化酶测试盒(南京建成生物工程研究所)。主要的抗体:p21、p16 一抗和HRP-标记的鼠及兔二抗购自Santa Cruz 公司，p53 和β-actin 一抗购自BD 生物科技公司。

1.3 SD 大鼠MSCs 体外培养 拉颈处死SD乳鼠(7 日龄)，剪去腹壁，用碘酒、75%乙醇擦拭后肢皮毛，取出乳鼠双侧股骨和胫骨，清除周围的肌肉和韧带，并用HBSS 液清洗3次，切除骨两端的干骺端，暴露骨髓腔，用含有8%肝钠素(500 IU/ml)的PBS 液冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心(1000 r/min，8 min)。用含15%FBS、584 mg/L 谷氨酰胺、105 IU/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM 培养液混悬沉淀细胞。以5×105个/ml 的细胞密度均匀接种到25 ml 的培养瓶中，在37℃和5% CO2培养箱中培养，48 h 后换液除去悬浮细胞，以后每3 d 换液1次，待细胞生长至80%融合时进行传代。后续试验均选用3～4 代的MSCs。

1.4 实验处理 在1.3 的基础上，各组MSCs吸去原培养液后，经PBS 液清洗3 遍，并进行不同的试验处理:①对照组，不含D-gal 的DMEM 培养液。②诱导组:用含1 g/L、10 g/L、50 g/L D-gal 的DMEM 培养液中培养MSCs。每组MSCs 取自6 只SD 乳鼠，各组均培养48 h后进行后续检测。

1.5 各组MSCs 衰老检测(衰老相关β-半乳糖苷酶染色法) MSCs 接种到培养皿中的盖玻片上，当细胞生长至80%融合时，随机分为4组(处理方法见1.4)，之后PBS 液清洗3次，4%多聚甲醛固定5 min 后，用酸性液(pH 6.0)清洗细胞2次。加入适量的衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)染色液，37℃下孵育12 h。在相差显微镜下随机选择3个视野，计数每100个细胞中阳性细胞的数目，每组实验重复5次。

1.6 各组MSCs 存活能力检测(AO/EB 染色法) 将MSCs 接种到培养皿中的盖玻片上，当细胞生长至80%融合时，各组进行相应处理(方法同上)，之后用PBS 清洗3次，加入AO/EB 染料30 min，混合均匀，PBS 清洗3次。荧光显微镜下，可见4 种细胞形态:①活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构;②早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状;③晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状;④死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构。细胞凋亡率由以下公式计算:细胞凋亡率=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA +NVA)×100%，每组实验重复5次。

1.7 各组MSCs 增殖检测 取对数生长期MSCs 制成细胞悬液，调整细胞浓度至3×104/ml，将细胞悬液接种于96 孔板中，每孔接种0.1 ml。各组分别培养1、2、3、4、5、6 和7 d(期间每3d 换液1次)，每天培养结束后各孔加入5 mg/ml 的MTT 孵育4 h，然后弃去孔内液体，每孔加入150μl 的DMSO，震荡10 min 后，酶标仪上读取波长为570 nm 的吸光度值，绘制细胞增殖曲线。每组设5个复孔。

1.8 各组MSCs 内氧化应激水平检测 总SOD(T-SOD)活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA 的测定采用硫代巴比妥酸法。各组细胞培养结束后，消化细胞，超声破碎收集细胞裂解液，后续具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。

1.9 Western blot 法检测细胞内p53，p21 和p16 表达 各组细胞处理结束后，RIPA 裂解液提取经处理的细胞总蛋白，冰浴30min 裂解混匀、4℃12 000 r/min 离心30 min 后，BCA 法测定总蛋白，SDS-PAGE 凝胶电泳后，转膜到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h 后，p53，p21 和p16或β-actin 一抗(1∶500～1∶1000 稀释)4℃孵育过夜，TPBS 洗膜，结合辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000 稀释)，TPBS 洗膜，采用ECL 化学发光法检测蛋白的表达。

1.10 统计学分析 采用SPSS 11.5 统计软件处理数据，结果用均数±标准差表示，各组间的差别采用单因素方差分析进行比较。首先采用F 检验进行方差齐性检验，P ＞0.05 认为方差齐，而后两两比较采用q 检验，当P＜0.05 时表示差异具有显著性。

2 试验结果

2.1 衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果 衰老相关β-半乳糖苷酶染色显示，在对照组中仅见少量细胞呈β-半乳糖苷酶染色阳性，而1 g/L D-gal、10 g/L D-gal、50 g/L D-gal 这3组β-半乳糖苷酶阳性细胞体积变大，形态扁平，10 g/L D-gal、50 g/L D-gal 两组阳性细胞数较多(图1A)。细胞计数结果表明，对照组β-半乳糖苷酶阳性细胞数目为(20.8±4.9)个/100 细胞，1 g/l D-gal、10 g/l D-gal、50 g/l D-gal 诱导组β-半乳糖苷酶阳性细胞数目依次为为(27.6±6.0)、(59.6±10.0)、(69.8±11.8)个/100 细胞，其中10 g/l D-gal、50 g/l D-gal组较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01，n=5)，说明在上述两组浓度下D-gal 可促进MSCs衰老(图1B)。

图1 D-gal 促进MSCs 衰老Fig.1 Effects of D-gal on MSCs aging

2.2 Western blot 法检测衰老相关蛋白表达结果 为进一步明确D-gal 对MSCs 衰老的作用，我们检测了D-gal 对衰老相关蛋白p53，p21 和p16 表达的影响。结果显示，随D-gal 处理浓度增高，MSCs 内p53、p21 和p16 表达逐渐增加(图2)。

图2 D-gal 促进MSCs 内p53、p21 和p16 表达Fig.2 D-gal can increase the p53，p21 and p16 expression in MSCs

2.3 AO/EB 双染检测MSCs 凋亡结果 AO/EB 双染结果显示，对照组细胞形态正常，未出现明显的细胞凋亡情况，1 g/L 和10 g/L D-gal组MSCs 仅有少量细胞表现出凋亡细胞的形态学表现，凋亡细胞出现细胞形态皱缩、染色体聚集、细胞质和细胞核内出现红染等表现，大部分细胞形态正常;而50 g/L D-gal组的MSCs 出现明显的凋亡和坏死变化(图3A)。凋亡率计数结果显示，1 g、10 g、50 g/L D-gal 诱导组细胞的凋亡 率 依次 为19.7%±4.6%、24.6%±8.5%、51.2%±9.9%，其中50 g/L D-gal组与对照组(11.9%±3.0%)的差异具有统计学意义(P＜0.01)，提示50 g/L D-gal 可以明显导致MSCs 凋亡、坏死(图3B)。

2.4 MTT 法检测MSCs 增殖结果 MTT 法检测MSCs 的增殖能力，结果表明培养第5～7天，10 g/L、50 g/L D-gal 诱导组的吸光度值较对照组降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明上述两组的细胞增殖能力较对照组有下降，表明D-gal 处理可抑制MSCs 的增殖能力(图4)。

图3 高浓度D-gal 可诱导MSCs 凋亡Fig.3 High-concentration D-gal can induce MSCs apoptosis

图4 D-gal 抑制MSCs 增殖Fig.4 D-gal can inhibit the proliferation of MSCs

2.5 D-gal 对MSCs 内氧化水平影响检测结果对照组SOD 活力为(35.1±7.2)U/mgprot，1、10、50 g/L D-gal 诱导组SOD 活力分别为(28.3±5.8)、(14.6±3.7)、(11.6±2.8)U/mgprot，检测结果表明SOD 活力随D-gal 浓度增高而逐渐降低;其中，10、50 g/L D-gal组的SOD 较对照组明显减少，具有统计学意义(P＜0.01，图5A)。对照组MDA 含 量为(8.7±2.5)mmol/mgprot，1、10、50 g/L D-gal 诱导组的MDA 含 量 为(14.6±4.4)、(27.5±5.4)、(29.9±6.2)mmol/mgprot，结果说明MDA 活力随D-gal 浓度增高而逐渐升高，其中10 g/L、50 g/L D-gal组的MDA 与对照组的差别有统计学意义(P＜0.01，n=5)。这些结果提示D-gal 可以促使MSCs 内氧化应激水平升高(图5B)。

3 讨论

当前，干细胞移植已成为临床治疗疾病的重要手段，研究表明，MSCs 在机体稳态维持和损伤修复中发挥重要作用，并已被广泛应用于干细胞移植治疗中［5］。然而，MSCs 也存在衰老现象，事实证明老年个体接受干细胞治疗的效果普遍不如年轻个体，严重影响了其移植疗效［6］。因此，延缓MSCs 衰老已成为干细胞衰老研究的热点，但目前，老年MSCs 由于其数量少，活性低，体外培养具有一定难度，严重影响了MSCs 的衰老研究进展。因此，体外人为构建稳定可靠的MSCs 衰老模型，具有重要的基础研究意义。

D-gal 诱导的衰老动物模型是目前国内常用的衰老诱导模型，具有复制方法简单、耗时短等优点，现已广泛用于个体衰老的机制以及延缓衰老药物筛选等研究中，但其在体外诱导细胞衰老中的研究仍较少，邢玉芝等研究了D-gal对MSCs 衰老的影响［13］，但未能明确D-gal 对MSCs 衰老相关蛋白表达及其存活能力的影响，这些都是细胞衰老鉴定的重要指标，同时D-gal诱导细胞衰老的作用机制也不明确。本实验通过检测不同浓度D-gal 诱导MSCs 衰老后，其衰老相关蛋白表达及其增殖、凋亡情况的改变，确定D-gal 诱导MSCs 衰老的最适浓度，并初步探讨D-gal 抑制细胞衰老的可能机理，为MSCs 衰老研究提供良好的体外模型。

图5 SOD、MDA 含量检测结果Fig.5 Effects of D-gal on SOD/MDA

3.1 不同浓度D-gal 对MSCs 衰老和凋亡的影响 本实验β-半乳糖苷酶染色结果显示，D-gal诱导下，10 g/L、50 g/L D-gal 诱导组的阳性细胞数目显著高于对照组(P＜0.01)，并呈现体积变大、形态扁平等衰老形态，且随D-gal 处理浓度提高，细胞内衰老相关蛋白p53，p21 和p16 表达逐渐增加，表明D-gal 体外诱导细胞衰老的作用依然存在，但低浓度(1 g/L组)作用不明显。在AO/EB 双染法结果表明，低浓度D-gal 可对MSCs 凋亡无明显影响;而高浓度Dgal(50 g/L)可诱导50%以上的MSCs 发生晚期凋亡或坏死，对细胞造成了很强损伤，不利于构建稳定的细胞衰老模型。邢玉芝等［13］也从MTT 检测中发现，8 g/L 的D-gal 处理MSCs，能够导致其增殖能力降低;而随着浓度的增加，16 g/L 的D-gal 处理后细胞呈负增长。因此，我们认为，10 g/L D-gal 具有良好的MSCs 衰老诱导作用，且可抑制细胞正常的增殖和存活能力;但50 g/L 浓度下，D-gal 的细胞损伤作用明显增强，故10 g/L 是D-gal 进行诱导MSCs 衰老的合适浓度。

3.2 D-gal 诱导MSCs 衰老的作用机制 细胞衰老的同时，常伴随着细胞内活性氧成分的增多［14］，我们前期研究也表面氧化应激水平升高是促进MSCs 衰老的重要原因［7］。SOD 是重要的抗氧化酶，可以清除细胞中过多的氧自由基，其活力可反映出细胞的抗衰老能力;如果SOD活力下降，多余的自由基就作用于脂质发生过氧化反应，产生大量的MDA，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有细胞毒性。MDA 含量能证明细胞内过氧化物质的水平。本研究结果显示，D-gal 可使细胞内SOD 的活力下降，而MDA 含量升高，且与浓度成正相关。由此我们推测，D-gal 可能通过氧化应激作用提高细胞的过氧化水平来促进细胞衰老，从而抑制其增殖分化，促进细胞内氧化应激水平升高可能是D-gal 在体外促进细胞衰老的作用机制之一。

综上，我们采用D-gal 诱导MSCs 细胞形态、数量和增殖能力的改变，结果提示，D-gal 体外构建MSCs 衰老模型的合适浓度是10 g/L，并揭示促进细胞内氧化应激水平升高可能是D-gal 诱导细胞衰老的作用机制，为进一步研究MSCs 衰老及其机理提供了可靠且有价值的实验数据。

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