正交设计优选五倍子提取工艺研究

★ 郑玲英 刘芳菊 王跃生 曾文雪 (1.南昌立健药业有限公司 南昌00;.石家庄四药有限公司 石家庄05001;.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌0006;4.江西中医学院

南昌330006)

五倍子为漆树科植物盐肤木Rhus chinensis Mill.等叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜 Melaphis chinensis(Bell)Baker寄生而形成。五倍子具有敛肺降火，涩肠止泻，敛汗，止血，收湿敛疮等功效［1］。五倍子中含有大量鞣质，鞣质具有收敛作用，是治疗久泻久痢、痈肿疮毒的有效成分之一，易溶于水。故采用传统水煎煮法提取芪仙冲剂中有效成分。

本实验以鞣质水解后的没食子酸为指标，采用L9(34)正交试验，对煎煮次数、煎煮时间、加水倍量等因素进行考察，以转移率、干浸膏得率为提取工艺的评价指标，优化其提取工艺，为其后续研究奠定基础。

1 仪器与试药

AL104/01电子天平(梅特勒－托利多仪器(上海)公司);RE－5210旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);RT－02L粉碎机(台湾荣联铁工厂);Agilent 1100系列高效液相色谱仪;KQ－250超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。

五倍子为漆树科植物盐肤木Rhus chinensis Mill、青麸杨 Rhus potaninii Maxin.叶上的虫瘿，由五倍子蚜寄生而形成，为肚倍，购自江西江中饮片厂，药材鉴定均符合《中国药典》2005版一部的规定。没食子酸对照品(含测用，批号:110831－200302，中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 没食子酸含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品12.5mg，置于250mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.05mg/mL的没食子酸溶液

2.1.2 供试品溶液的制备 取五倍子粉末(过四号筛)约10 g，加入10倍量的水，提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，定容至500mL容量瓶中。精密吸取5mL置塞锥形瓶中，水浴挥干，精密加入4mol/L盐酸溶液50mL，水浴中加热水解3.5小时，放冷，滤过。精密量取续滤液1mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 色谱条件［2］色谱柱:Hypersil ODS 柱(250mm ×4.6mm，5μm);流动相:甲醇:0.05%磷酸水溶液(5:95);检测波长:271nm;流速:1mL/分;柱温:25℃。

2.1.4 标准曲线的制备 分别精密吸取2.1.1项下对照品溶液 2.5，5，10，15，20 mL 至 25mL 量瓶中，加水稀释至刻度。分别精密吸取10μL，依次注入液相色谱仪，进行测定，以峰面积对浓度(μg/mL)进行线性回归，得回归方程Y=39.944X+17.758(r=0.999 8)。结果表明，没食子酸在 0.1μg －0.534μg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10μL，按上述色谱条件，重复进样5次，测定对照品溶液中没食子酸峰面积值，结果RSD=0.96%。

2.1.6 稳定性试验 取同一份提取液供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12 小时进样，测定峰面积，结果表明供试品溶液在12小时内峰面积积分值基本稳定，RSD=0.83%。

2.2 正交试验优选提取工艺

2.2.1 正交设计优化工艺 以浸膏得率以及五倍子中的没食子酸含量为考察指标采用正交试验，考察不同加水量，提取次数，提取时间对提取效果的影响，每个因素确定为3个水平，见表1。

表1 提取工艺因素水平表

2.2.2 提取试验 称取五倍子九份，每份称取处方原药材36.64 g，按表 2.1.2 中的方法，采用 L9(34)正交表安排试验进行提取，提取液浓缩并定容至250mL，以供测定没食子酸含量以及浸膏得率。

2.3 膏得率的测定

用移液管精密移取2.2项下定容到250mL的提取液25mL置于已干燥至恒重的蒸发皿中，先于水浴上挥干，然后按2005年版中国药典一部附录IX H烘干法进行测定，即将盛有样品溶液的蒸发皿置于烘箱中，在105℃下干燥3小时，然后移置于干燥器中冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续2次称重的差异不超过5 mg为止。根据以下公式计算药材干浸膏的得率。

2.4 没食子酸转移率及浸膏得率的测定结果

按2.1.3项下的色谱条件，测定各正交试验提取液中的没食子酸含量，并测定其浸膏得率，计算没食子酸的转移率，进行极差和方差分析，结果见表2－4。

表2 正交实验方案及试验结果分析结果

表3 以没食子酸转移率为为指标的方差分析表

表4 以浸膏得率为指标的方差分析表

结果分析:由方差分析表和正交试验结果可以看出，以没食子酸转移率为指标因素A有显著性差异，以浸膏得率为指标因素A和B有显著性差异，三因素对提取的影响效果程度为A＞B＞C，故结合直观分析，考虑节约成本，缩短工艺时间，确定组合工艺为A2B2C2，即加10倍量水，煎煮2次，每次煎煮2小时。

2.5 验证试验

称取药材三份，按优选工艺进行验证试验。实验方法同上，测定没食子酸的转移率和浸膏得率，结果见表2。

表2 验证试验结果

验证试验结果表明，按优选的提取工艺提取，所得没食子酸的转移率和浸膏得率稳定，表明工艺可行。

3 讨论

水为中药提取中最常用的溶剂，具有价廉，易得，安全，无毒，无污染等特点。五倍子中的主要有效成分为鞣质及没食子酸，其中五倍子鞣质又叫单宁酸，易溶于水，因此本文采用水煎煮法提取五倍子的有效成分。

五倍子中具有多种有效成分，故本试验对五倍子提取物的浸膏得率进行了研究，以最大化提取其中的有效成分群。

［1］国家药典委员会.中国药典2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社。2010:62.

［2］刘芳菊，王跃生，罗晓健，等.HPLC法测定芪仙汤微丸中没食子酸含量［J］.江西中医药，2009，，40(5):63 －64.