脱氢抗坏血酸在重铬酸钾对A549细胞毒性效应中的作用

画宝勇，马丽华，李时恩

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001 2)郑州大学口腔医学院 郑州 450052

铬在自然界中分布广泛，六价铬[Cr(Ⅵ)]已被证实具有致癌性，其所致的肺癌是8种职业性肿瘤之一。有研究[1-3]表明，活体细胞内90%的抗坏血酸(ascorbic acid，Asc)参与Cr(Ⅵ)的还原代谢，且是Cr(Ⅵ)的主要还原剂。机体肺细胞内Asc的平均水平为1.3 mmol/L[4]，但在体外细胞培养中含量却非常低[5-6]，脱氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid，DHA)孵育可以使细胞内氧化形成Asc，使其达到或接近机体正常生理浓度[7]。Reynolds等[8]发现DHA孵育H460和IMR90细胞90 min后，再用Cr(Ⅵ)染毒细胞，细胞的急性毒性增强。作者用DHA孵育A549细胞后，观察重铬酸钾(K2Cr2O7)对A549细胞的增殖及毒性作用，探讨DHA在K2Cr2O7致A549细胞损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1实验材料、主要试剂人胚肺A549细胞购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。K2Cr2O7(天津化工厂)，DMEM/F12(美国Gibco公司)，优级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DHA、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国Sigma公司)，Sunrise Remote 酶标仪(奥地利TECAN公司)。

1.2DHA对K2Cr2O7刺激的A549细胞增殖的影响用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液复苏A549细胞，培养传2代后用于实验。当A549细胞铺瓶底达80%～90%时，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，调整密度为4.0 ×104mL-1，以每孔200 μL接种于96孔板，接种6板。每板设空白组与DHA组各两组(DHA组预先于0.6 mmol/L的DHA无血清培养液中孵育90 min，弃旧液，PBS洗3遍)，分别用培养液或10.00 μmol/L的K2Cr2O7孵育3 h，弃旧液，PBS洗3遍。然后用含血清的培养液常规培养。共24组，每组均设置8个复孔。每过24 h拿出1板，MTT法检测A549细胞的增殖情况。连续6 d，中途不更换培养液。

1.3DHA对不同浓度K2Cr2O7刺激的A549细胞毒性的影响消化A549细胞，按每孔3.5×104个细胞接种于96孔板，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后弃原培养液，实验组用DHA 孵育90 min后，分别加入含0.00、1.25、2.50和5.00 μmol/L K2Cr2O7的无血清DMEM/F12培养液；对照组弃原培养液后，直接加入含以上浓度K2Cr2O7的无血清DMEM/F12培养液。每浓度组设8个复孔，继续培养24 h，MTT法检测细胞活性。并计算细胞增殖抑制率及IC50。细胞增殖抑制率=(1-实验组D值/对照组D值)×100%。

1.4统计学处理采用SPSS 12.0进行分析，应用2×2×6析因设计方差分析方法比较DHA、 K2Cr2O7与不同培养时间对A549细胞增殖的影响。采用简单线性回归模型分析K2Cr2O7和细胞增殖抑制率之间的浓度-效应关系，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1DHA对K2Cr2O7刺激的A549细胞增殖影响的结果见表1。DHA刺激可影响细胞增殖(FDHA=38.189，PDHA=0.001)，但是，无K2Cr2O7刺激时，DHA组细胞均在第4 d增殖达到顶峰，第5 d出现生长抑制趋势，分析发现单独DHA对细胞增殖没有影响(P>0.05)；而K2Cr2O7刺激可抑制细胞增殖能力(FK2Cr2O7=4 045.865，PK2Cr2O7<0.001)；且在DHA与K2Cr2O7同时存在时细胞增殖抑制程度明显高于K2Cr2O7组，两者具有交互作用(F交互=32.665，P交互=0.007)。

2.2DHA对不同浓度K2Cr2O7刺激的A549细胞的毒性作用见表2。随K2Cr2O7浓度的增加细胞增殖抑制率呈线性升高趋势，浓度-效应回归方程为：Y=12.58X+2.92(R2=0.962)，见图1。

表1 K2Cr2O7刺激后A549细胞增殖情况(n=8)

FDHA=38.189，PDHA=0.001；FK2Cr2O7=4 045.865，PK2Cr2O7<0.001；F时间=873.147,P时间<0.001,FDHA和K2Cr2O7交互=32.665；PDHA和K2Cr2O7交互=0.007。

表2 K2Cr2O7染毒24 h后A549细胞增殖抑制情况(n=8)

图1 K2Cr2O7染毒24 h后A549细胞增殖抑制情况

3 讨论

Cr(Ⅵ)是一种重金属环境污染物，具有较强的氧化能力，可以导致DNA损伤、干扰DNA修复，若这些损伤的细胞不被修复，并逃避凋亡，在体内继续增殖就会引起DNA的突变，进而致癌。活体细胞内90%的Asc参与Cr(Ⅵ)的还原代谢，是Cr(Ⅵ)的主要还原剂[1-3]。有研究[5]认为Asc能在细胞外生成H2O2对细胞造成氧化损伤。

Reynolds等[8]采用在细胞染毒前90 min孵育DHA来形成氧化形式Asc的方法，来弥补体外培养条件下细胞内Asc含量很低的不足。作者采用MTT法检测DHA在不同时间、相同浓度K2Cr2O7刺激A549细胞时细胞增殖的抑制率，以及DHA在相同时间、不同浓度K2Cr2O7刺激A549细胞时细胞的增殖抑制率，以此来验证DHA在K2Cr2O7对A549细胞毒性效应中的作用。结果显示，K2Cr2O7刺激可抑制细胞的增殖能力；但是，在DHA与K2Cr2O7同时存在时细胞增殖抑制程度明显增高，两者具有交互作用。相同时间时，随K2Cr2O7浓度的增加，细胞增殖抑制率呈线性升高趋势，即提高细胞内Asc的含量后，同剂量K2Cr2O7对A549细胞产生了不同程度的损伤。因此，推测细胞内Asc含量增加后与K2Cr2O7的氧化还原反应产生的活性氧的量和结合物的量增加，结合并损伤DNA的程度加剧，DNA修复机制不能完全修复损伤，启动凋亡机制使细胞凋亡，细胞死亡增多，细胞增殖抑制率增高。这与国内外的研究[9-10]报道一致。

综上所述，DHA促进了K2Cr2O7对A549细胞的毒性作用。但具体机制不明，仍需要做进一步的研究。

[1]Salnikow K,Zhitkovich A.Genetic and epigenetic mechanisms in metal carcinogenesis and cocarcinogenesis：nickel，arsenic，and chromium[J].Chem Res Toxicol，2008，21(1)：28

[2]刘永，徐新华，江栋.L-抗坏血酸还原降解六价铬的影响因素[J].环境科学研究，2008，21(4)：25

[3]Altun T，Pehlivan E.Removal of Cr(Ⅵ)from aqueous solutions by modified walnut shells[J].Food Chem，2012，132(2)：693

[4]Reynolds M，Armknecht S，Johnston T，et al.Undetectable role of oxidative DNA damage in cell cycle，cytotoxic and clastogenic effects of Cr(Ⅵ)in human lung cells with restored ascorbate levels[J].Mutagenesis，2012，27(4)：437

[5]李霞.牙周膜细胞膜片构建过程中L-抗坏血酸-2-磷酸酯的应用及观察[J].山东医药，2012，52(22)：22

[6]Karaczyn A，Ivanov S，Reynolds M，et al.Ascorbate depletion mediates up-regulation of hypoxia-associated proteins by cell density and nickel[J].J Cell Biochem，2006，97(5)：1025

[7]Reynolds M，Stoddard L，Bespalov I，et al.Ascorbate acts as a highly potent inducer of chromate mutagenesis and clastogenesis：linkage to DNA breaks in G2 phase by mismatch repair[J].Nucleic Acids Res，2007，35(2)：465

[8]Reynolds M，Zhitkovich A.Cellular vitamin C increases chromate toxicity via a death program requiring mismatch repair but not p53[J].Carcinogenesis，2007，28(7)：1613

[9]赵文静，钟才高，边鬟锋，等.维生素C在Cr(Ⅵ)诱导L-02肝细胞氧化损伤中的双面作用[J].卫生研究，2009，38(3)：310

[10]Martin BD，Schoenhard JA，Hwang JM，et al.Ascorbate is a pro-oxidant in chromium-treated human lung cells[J].Mutat Res，2006，610(1/2)：74