DIAPH3基因与听神经病谱系障碍＊

张娇 综述 王秋菊 审校

听神经病谱系障碍（auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD），也称为听神经病（auditory neuropathy，AN），是一种外毛细胞功能正常，而内毛细胞和听神经突触和／或听神经本身功能不良导致的听功能障碍［1，2］。ANSD 典型的临床表现［3～7］是言语理解力受损，而言语觉察阈和纯音听阈可以正常，也可以严重受损。ANSD 主要影响对快速变化声信号的处理，即听觉时间处理的能力［3］。

ANSD 的病因可为非遗传因素和遗传因素。非遗传性因素［8～10］包括高胆红素血症、缺氧、营养代谢性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、中毒性代谢性疾病等。近年来，随着分子遗传学研究的不断深入，遗传因素在ANSD 发病中的作用日益受到重视。在引起听神经病谱系障碍的众多因素中，遗传因素约占40%［11］，其遗传方式涉及4种主要遗传途径，即常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X－染色体连锁遗传、线粒体遗传。根据是否合并其他系统的疾病，ANSD 又可分为非综合征型和综合征型。很多ANSD 患者表现为非综合征型遗传，其中与常染色体显性遗传性相关的基因是DIAPH3（diaphanous homolog 3）基因［12，13］，与常染色体隐性遗传相关的基因有 OTOF［14］、PJVK［15］和GJB2［16］，表现为X－染色体连锁遗传的基因座有AUNX1［17］，与线粒体遗传相关的基因突变有12SrRNA T1095C突变［18］。其中，DIAPH3基因是第一个发现的与常染色体显性遗传性ANSD 相关的致病基因［11］，本文对该基因的结构、功能及其与ANSD 的关系等综述如下。

1 DIAPH3基因的结构

DIAPH3基因又名AUNA1基因、DRF3基因，定位于13q21.2，DNA 序列全长498 403bp，含29个外显子。由于剪接位点的不同，DIAPH3 基因有多种不同的转录变异体（表1），包括isoform a、isoform b、isoform c、isoform d、isoform e、isoform f、isoform g。有研究报道不同的转录本具有组织和时间特异性［19］，其中，isoform a 最长，常作为DIAPH3基因cDNA 的标准序列［20］，其mRNA 全长4 812bp，CDS 在mRNA 的220bp～3 801bp 区域，编码含有1 193个氨基酸的蛋白质。

表1 DIAPH3基因的不同转录本及其编码的蛋白质

DIAPH3基因编码的蛋白质diaphanous homolog 3（DIAPH3蛋白），是一种多结构域的蛋白（图1），包含一个氨基端的GTPase结合结构域（GTPase binding domain，GBD）长度为183个氨基酸残基（115～297）；一个FH3结构域（formin homology 3，FH3），长度为193个氨基酸残基（302～494）；一个FH2结构域（formin homology 2，FH2），长度为374个氨基酸残基（636～1 009）；一个C 端diaphanous自调节结构域（diaphanous antoregulatory domain，DAD），长度为15 个氨基酸残基（1 060～1 074）［20～22］。DIAPH3蛋白属于diaphanous相关成蛋白家族（diaphanous－related formins），目前已发现了该家族的3 个亚型（DIAPH1、DIAPH2、DIAPH3），DIAPH 3 与DIAPH1（5q31.3）有51.3%的同源性，与DIAPH2（Xq22）有57.3%的同源性。其中，DIAPH1基因与常染色体显性遗传性非综合征型感音神经性聋相关，DIAPH2与X－连锁的卵巢功能早衰相关。人类DIAPH3 基因和蛋白与黑猩猩、猕猴、狗、牛、小鼠、大鼠及鸡的同源核酸及蛋白质序列在进化分析上高度保守［20］。

Schoen等［12］应用RT－PCR 和Northern blot技术发现DIAPH3 基因是广泛表达的。目前尚无DIAPH3 基因在内耳的精确表达模式和具体表达部位的报道。

2 DIAPH3基因的功能研究

天然状态下DIAPH3蛋白通过细胞内FH3的DID（diaphanous inhibitory domain）结构域（即di－aphanous抑制区）和羧基端的DAD 区域间相互作用而使得其活性处于自抑制状态［23，24］。当活化的Rho GTPase结合GBD 后，这种自抑制状态被解除，暴露出FH2和DAD的功能区，使之活化而促进肌动蛋白的聚集成核、延伸、加帽及微丝的继续伸长等（图1），最终对细胞粘附、细胞运动、细胞形态发生、细胞内运输、囊泡运输等起重要的调控作用［25～27］。此外，有研究发现GBD结构域决定DIAPH3蛋白的亚细胞定位，并影响囊泡和丝状伪足的的活动［19］。

图1 DIAPH3蛋白的结构域组成和分子内调节

Pawson等［28］在大规模筛查维持果蝇神经肌肉接头生长和／或稳定所必须的基因时，发现diaphanous是突触生长的重要调控因子；对果蝇行免疫组织荧光分析发现，diaphanous蛋白既存在于神经肌肉接头处的突触前成分，也存在于其突触后成分，同时发现diaphanous 蛋白作用于受体酪氨酸激酶Dlar的下游，通过调控神经肌肉接头处突触前膜的肌动蛋白和微管细胞骨架，最终影响神经肌肉接头处的突触的生长。

3 DIAPH3基因与ANSD

2004年Kim 等［29］报道了一个欧洲的常染色体显性遗传性ANSD 大家系，共研究了4代47人，均排除了颅神经和周围神经病变，均为非综合征型ANSD，其中2人经测序发现为纯合突变，且与其余杂合突变的患者相比，除发病年龄较小外，临床表现无明显差异。Kim 等应用单体型分析发现18岁以上的患者外显率均为100%。该家系平均发病年龄为18.6岁。发病年龄最小的患者外毛细胞功能正常（可引出正常的OAE），而听力有损失（根据纯音测听和／或ABR 结果），后随着时间的推移，OAE消失，且听阈提高，最后发展为极重度感音神经性聋。Kim 等通过连锁分析将该家系精确定位在13q14～21上的D13S153和D13S1317之间5.47厘摩的范围，并将该位点命名为AUNA1，该家系命名为AUNA1家系［29］。

2010年，Starr等［30］进一步研究了AUNA1家系的临床听力学表型（表2），发现该家系的发病年龄为7～45岁，而在随后的20年内逐渐进展为极重度感音神经性聋。该家系典型的症状为言语识别率明显降低，有88%的患者反映言语理解能力下降，72%的患者反映在噪声环境下言语理解能力进一步下降，72%的患者电话沟通有困难；38%的患者自觉助听设备“有效”，可放大声音，但不能提高言语识别率。该家系中3名患者行人工耳蜗植入术后，听功能显著提高，主要表现为电诱发听性脑干反应（EABRs）、听觉时间处理能力和言语识别率明显改善。据此Starr等提出，该家系患者的病变部位主要在听神经远端，包括螺旋神经节的树突棘末端、内毛细胞及二者之间的突触，而螺旋神经节细胞及其轴突功能完好，属于远端ANSD，即II型ANSD。此外，因该家系听力损失的类型从年轻时的ANSD转为老年时的感音神经性聋，提示该家系的ANSD和感音神经性聋可能是同一疾病不同时期的病理过程。

表2 AUNA1家系的临床听力学特点

Schoen 等［12］研究AUNA1 家系时，对家系中一个亲缘关系较远的患者DNA 样本行基因型分型，将AUNA1 基因座进一步缩窄到长度约为11Mb、3.28cM 的区域，其中包含PCDH17 、PCDH20、TDRD3和DIAPH3共4个基因。PCDH17、PCDH20、TDRD3 的测序分析未发现任何突变，DIAPH3基因的测序分析发现其5＇UTR 区高度保守的GC框有c.－172G＞A 的突变，且与ANSD 表型共分离。随后应用微阵列基因表达技术，Schoen等发现受累患者淋巴母细胞系的DIAPH3基因的mRNA 较正常对照组过表达2～3倍。其中，杂合突变患者有2.11 倍的过表达，而纯合突变患者有2.98倍的过表达；应用定量免疫印迹技术发现受累患者的淋巴母细胞系的DIAPH3蛋白较正常对照组有1.5倍的过表达，其中，杂合突变患者有1.48倍的过表达，而纯合突变患者有1.62 倍的过表达［12］。Schoen等进一步将可能的启动子和5，UTR区（突变型、野生型）克隆到一个荧光素酶报告载体上，观察c.－172G＞A 突变对DIAPH3 基因表达的影响，结果发现5，UTR 区c.－172G＞A 突变明显上调了DIAPH3基因的表达，相对于野生型有约2～3倍的过表达，证实DIAPH3基因的5＇UTR 区对于转录调控有重要作用［12］。通过比较纯合突变患者和正常对照组DIAPH3基因cDNA 的PCR 产物，Schoen等发现两组的DIAPH3转录本无论是数量还是种类都无统计学差异，排除了DIAPH3基因的过表达是由不同转录本引起的这一猜想。为进一步研究diaphanous蛋白对听觉系统的影响，Schoen建立了黑腹果蝇动物模型，其听觉器官（Johnston’s organ，JO）可表达持续激活的diaphanous蛋白。实验发现除少数果蝇死亡外，存活的果蝇声诱发电位SEPs均显著降低，约为0.25～0.75mV，而野生型果蝇的声诱发电位为0.5～1.3mV，说明DIAPH3基因突变可影响听觉器官的功能［12］。

通过上述一系列试验，Schoen等证实DIAPH3基因是首个与非综合征型显性遗传性ANSD 相关的基因［12］，其可能的致聋机制如下：DIAPH3基因的过表达影响螺旋神经节树突棘的功能［31］，由于听神经传入纤维螺旋神经节树突95%支配内毛细胞，5%分布于外毛细胞［32］，当螺旋神经节树突棘存在缺陷时，起初内毛细胞受的影响更大，故病变早期，主要表现为中度听力损失，ABR 缺失或者明显异常，而DPOAE 和／或CMs存在。有文献报道diaphanous蛋白参与调控神经肌肉接头处突触前成分的肌动蛋白和微管细胞骨架［30］，从而调节毛细胞的形态和静纤毛的长度［33，34］。DIAPH3 基因过表达最终影响到内、外毛细胞的功能，表现为极重度听力损失，ABR、DPOAE、CMs均引不出。因此，DIAPH3基因突变引起的ANSD 早期影响突触后成分（螺旋神经节树突棘），晚期逐渐累及突触前成分（内、外毛细胞）［35］。

4 DIAPH3基因的筛查情况

Schoen等对AUNA1 家系4 代47 人行DIAPH3基因测序分析，发现DIAPH3基因5＇UTR 区高度保守的GC框有c.－172G＞A 的突变，并经一系列试验证明其为 AUNA1 家系的致病突变［12，23，24］。卢新红等［36］对一个现存3代9人的常染色体显性遗传性ANSD 核心家系所有成员行DIAPH3基因5＇UTR区测序分析，并对其中1例患者行DIAPH3基因全部编码区筛查，结果无阳性发现。

自2004 年首次鉴定AUNA1 基因座，并于2008年发现AUNA1家系的致病基因（DIAPH3 基因）至今，仅在AUNA1家系中发现该基因的1种致病突变，即5＇UTR 区的c.－172G＞A 突变。目前，尚未在中国ANSD 患者及其他耳聋患者中发现该基因的突变。

5 展望

DIAPH3基因对细胞粘附、细胞运动、细胞形态发生、细胞内运输、囊泡运输等起重要的调控作用［27～29］，近年来，随着分子遗传学、细胞生物学、分子生物学、生物信息学等的发展，DIAPH3 基因及其对ANSD 影响的相关研究逐渐深入。然而尚有许多问题亟待解决，如DIAPH3 基因在内耳的精确表达模式和具体表达部位尚不清楚；5，UTR区c.－172G＞A 突变致DIAPH3 基因过表达的机制目前仍是个谜；DIAPH3 基因过表达如何导致ANSD 的机制仍停留在假说水平，并且DIAPH3基因的长期效应还有待进一步研究。DIAPH3 基因的相关研究将为ANSD 的发病机理、病理分型、治疗方式的选择、预后及可能的基因治疗奠定理论基础。

1 Starr A，Picton TW，Sininger Y，et al.Auditory neuropathy［J］.Brain，1996，119：741.

2 Berlin CI，Hood LJ，Morlet T，et al.Multi－site diagnosis and management of 260patients with auditory neuropathy／dys－synchrony（auditory neuropathy spectrum disorder）［J］.Int J Audiol，2010，49：30.

3 Sanyelbhaa Talaat H，Kabel AH，Samy H，et al.Prevalence of auditory neuropathy（AN）among infants and young children with severe to profound hearing loss［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2009 73：937.

4 Dowley AC，Whitehouse WP，Mason SM，et al.Auditory neuropathy：unexpectedly common in a screened newborn population［J］.Dev Med Child Neurol，2009，51：642.

5 王锦玲.听神经病的诊断及病变部位探讨［J］.医学研究生学报，2008，21：1 121.

6 倪道凤.听神经病临床研究现状［J］.听力学及言语疾病杂志，2005，13：226.

7 兰兰，韩东一，王秋菊，等.听神经病患者最大言语识别率与纯音听阈的相关性分析［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，43：341.

8 Bielecki I，Horbulewicz A，Wolan T.Prevalence and risk factors for auditory neuropathy spectrum disorder in a screened newborn population at risk for hearing loss［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2012，76：1 668.

9 Ye HB，Shi HB，Wang J，et al.Bilirubin induces auditory neuropathy in neonatal guinea pigs via auditory nerve fiber damage［J］.J Neurosci Res，2012，90：2201.

10 Coenraad S，Goedegebure A，van Goudoever JB，et al.Risk factors for auditory neuropathy spectrum disorder in NICU infants compared to normal－hearing NICU controls［J］.Laryngoscope，2011，121：852.

11 Manchaiah VK，Zhao F，Danesh AA，et al.The genetic basis of auditory neuropathy spectrum disorder（ANSD）［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2011，75：151.

12 Schoen CJ，Emery SB，Thorne MC，et al.Increased activity of Diaphanous homolog 3 （DIAPH3）／diaphanous causes hearing defects in humans with auditory neuropathy and in Drosophila［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107：13 396.

13 Del Castillo FJ，Del Castillo I.Genetics of isolated auditory neuropathies［J］.Front Biosci，2012，17：1 251.

14 Wang DY，Wang YC，Wang QJ，et al.Screening mutations of OTOF gene in Chinese patients with auditory neuropathy，including a familial case of temperature－sensitive auditory neuropathy［J］.BMC Med Genet，2010，11：79.

15 Delmaghani S，del Castillo FJ，Michel V，et al.Mutations in the gene encoding pejvakin，a newly identified protein of the afferent auditory pathway，cause DFNB59auditory neuropathy［J］.Nat Genet，2006，38：770.

16 Chang EH，Van Camp G，Smith RJ.The role of connexins in human disease［J］.Ear Hear，2003，24：314.

17 Wang QJ，Li QZ，Rao SQ，et al.AUNX1，a novel locus responsible for X linked recessive auditory and peripheral neuropathy，maps to Xq23－27.3［J］.J Med Genet，2006，43：e33.

18 Wang Q，Li R，Zhao H，et al.Clinical and molecular characterization of a Chinese patient with auditory neuropathy associated with mitochondrial 12SrRNA T1095C mutation［J］.Am J Med Genet A，2005，133：27.

19 Stastna J，Pan X，Wang H，et al.Differing and isoformspecific roles for the formin DIAPH3in plasma membrane blebbing and filopodia formation［J］.Cell Res，2012，22：728.

20 Katoh M，Katoh M.Identification and characterization of human DIAPH3gene in silico［J］.Int J Mol Med，2004，13：473.

21 Schönichen A，Geyer M.Fifteen formins for an actin filament：A molecular view on the regulation of human formins［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1 803：152.

22 Higgs HN.Formin proteins：a domain－based approach［J］.Trends Biochem Sci，2005，30：342.

23 Wallar BJ，Stropich BN，Schoenherr JA，et al.The basic region of the diaphanous－autoregulatory domain（DAD）is required for autoregulatory interactions with the diaphanousrelated formin inhibitory domain［J］.J Biol Chem，2006，281：4 300.

24 Gorelik R，Yang C，Kameswaran V，et al.Mechanisms of plasma membrane targeting of formin mDia2through its amino terminal domains［J］.Mol Biol Cell，2011，22：189.

25 Wallar BJ，Alberts AS.The formins：active scaffolds that remodel the cytoskeleton［J］.Trends Cell Biol，2003，13：435.

26 Eng CH，Huckaba TM，Gundersen GG.The formin mDia regulates GSK3beta through novel PKCs to promote microtubule stabilization but not MTOC reorientation in migrating fibroblasts［J］.Mol Biol Cell，2006，17：5 004.

27 Chesarone MA，DuPage AG，Goode BL.Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11：62.

28 Pawson C，Eaton BA，Davis GW.Formin－dependent synaptic growth：evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules［J］.J Neurosci，2008，28：11 111.

29 Kim TB，Isaacson B，Sivakumaran TA，et al.A gene responsible for autosomal dominant auditory neuropathy（AUNA1）maps to 13q14－21［J］.J Med Genet，2004，41：872.

30 Starr A，Isaacson B，Michalewski HJ，et al.A dominantly inherited progressive deafness affecting distal auditory nerve and hair cells［J］.J Assoc Res Otolaryngol，2004，5：411.

31 Hotulainen P，Llano O，Smirnov S，et al.Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis［J］.J Cell Biol，2009，185：323.

32 Spoendlin H.Anatomy of cochlear innervation［J］.Am J Otolaryngol，1985，6：453.

33 Kollmar R.Who does the hair cell＇s＇do？Rho GTPases and hair－bundle morphogenesis［J］.Curr Opin Neurobiol，1999，9：394.

34 Lin HW，Schneider ME，Kachar B.When size matters：the dynamic regulation of stereocilia lengths［J］.Curr Opin Cell Biol，2005，17：55.

35 Santarelli R.Information from cochlear potentials and genetic mutations helps localize the lesion site in auditory neuropathy［J］.Genome Med，2010，2：91.

36 卢新红，陈睿春，鲁雅洁，等.常染色体显性遗传性听神经病家系候选致病基因突变筛查［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2012，26：455.