Wnt10b 肝细胞肝癌中的表达＊

浮凤洲，范晓丽，孙 莉，△

（桂林医学院临床：1.医学院；2.基础医学院，广西桂林541004）

肝细胞肝癌（以下简称肝癌）是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和高病死率的特点，近年来其发病率呈增高趋势。Wnt 通路由多种癌基因和抑癌基因编码的蛋白质组成，是一种与调节胚胎发育以及肿瘤发生发展相关的蛋白信号传导通路［1］。Wnt 通路与肿瘤相关的研究已成为当前的研究热点。Wnt 信号通路中与β-catenin 聚集密切相关的信号通路称为经典Wnt 信号通路，除此以外的Wn t 信号通路称为非经典Wnt 信号通路。Wnt10b 是Wnt 家族成员之一，由2.2 kb的m RNA编码的389个氨基酸构成，相对分子质量为43 ×103。研究证实Wnt10b 通过经典途径在肿瘤发生发展中发挥作用，并且在体外肝癌细胞株的研究中发现Wnt10b高表达［2］。本研究采用荧光定量PCR和Western blot 技术分别检测33例肝癌组织及其对应癌旁组织中Wnt10b m RNA及蛋白的表达，初步探讨Wnt10b 在肝癌中的表达规律及其与临床病理参数之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2012年6月至2013年5月桂林医学院附属医院原发性肝细胞肝癌手术标本33对，按照C1、N1、C2、N2……C32、N32、C33、N33 编号，C代表癌组织，N代表癌旁组织。所有入组患者术前均未经放化疗及其他抗癌治疗。

1.1.2 试剂 RNAiso 试剂、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒均购自大连Takara 公司，BCA蛋白定量试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司，鼠抗人单克隆抗体及羊抗鼠IgG购自美国Aviva Systems Biology公 司，β-actin鼠 抗 人 单 克 隆 抗 体 购 自 美 国Santa Cruz 公司。引物均由Invi t rogen 公司合成。Wnt10b 正向引物：5′-TTG ATA CCC ACA ACC GCA AT-3′；Wnt10b 反向引物：5′-GTG CTC GCT CAC AGA AGT CAG G-3′，β-actin正向引物：5′-GGC ATC CTC ACC CTG AAG T-3′，β-actin 反向引物：5′-GGG ATA GCA CAG CCT GGA T-3′，

1.1.3 仪器 ABI 7500 FAST荧光定量PCR扩增仪，美国ABI 公司；紫外分光光度计，美国ABI 公司；电泳转膜仪，北京六一仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 分离肿瘤及癌旁组织 手术标本切除后立即取材，避开肿瘤坏死与出血部位，无菌条件下取肿瘤组织及癌旁组织（用工具尺测量距瘤块外缘3 cm以上）各2 块，标本大小约1 cm ×1cm ×1 cm，一块置于甲醛固定液中固定，制做组织切片并进行苏木素-伊红（HE）染色，邀2 名病理学专家对切片进行病理学鉴定，另一块在组织离体后20 min 内置于液氮中速冻，然后储存于-80 ℃冰箱，用于RNA和蛋白提取。

1.2.2 总R N A和蛋白的提取 取冻存的组织标本，每例组织标本称取100 mg 加入1 m L RNAiso，在冰浴中进行匀浆处理，直至匀浆液呈颗粒无透明状，向匀浆裂解液中加入0.2 m L的氯仿，盖紧离心管盖，用手猛烈振荡15 s，待乳液充分乳化，无分相现象后，室温静置5 min，然后12000 r／min 4℃离心15 min，取出分相清楚的离心管，转移上清液至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10 min，12000 r／min 4 ℃离心10 min，有沉淀析出，弃上清液，75%乙醇洗涤沉淀后小心弃去乙醇，室温干燥沉淀5 min，加入0.04 m L焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解沉淀。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的均一性和完整性，用紫外分光光度计测定总RNA的纯度和含量，A260／A280在1.8～2.0之间时，读取RNA浓度。

1.2.3 cDNA合成 按PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒说明书分两步进行cDNA合成，第一步：取总RNA 3.0μL，Oligo d T Primer 1.0μL，d NTP mixture 1.0 μL，RNase free d H2O 4.5μL，反应条件为42 ℃2 min；第二步：向第一步反应管中加5 ×PrimeScript Buffer 4.0μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimeScript RTase 1.0 μL，RNase Free d H2O 4.5μL，反应条件为37 ℃15 min，85 ℃5 s。反应产物放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 荧光定量PCR采用SYBR法，使用ABI 7500 Fast Real Time PCR System进行PCR扩增和结果分析，反应体系：2 ×SYBR Premix Ex Taq TMⅡ10.0μL，上、下游引物各0.8 μL，50 ×ROX Reference DyeⅡ0.4μL，cDNA模板2μL，加去RNase 水至20μL。两步法PCR扩增：95℃30 s；95℃3 s，60℃30 s，40个循环。每个样品均作复管反应，重复3次，以DEPC 处理水作为阴性对照。所有样品均在相同反应条件下进行Wnt10b m RNA检测。采用2-△△CT法对扩增产物定量计算，△CT＝CTWnt10b-CTβ-actin，△△CT＝△CT 癌-△CT癌旁＝（CTwnt10b-CTβ-actin）癌-（CTWnt10b-CTβ-actin）癌旁。C代表Cycle（扩增循环数），T代表threshol ds（扩增域值），CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

1.2.5 PCR产物测序 在CEQ8000 测序仪上进行PCR产物测序，以鉴定PCR产物特异性。

1.2.6 Western blot 检测Wnt10b 蛋白的表达 分别提取肝癌和癌旁组织的总蛋白，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转移电泳产物至硝酸纤维素膜上，于5%脱脂奶粉中室温封闭1.5 h。加一抗（鼠抗人Wnt10b 单克隆抗体，1∶1500 稀释），置于4℃冰箱反应过夜。TBST洗涤3遍，每次10 mi n，加二抗（羊抗鼠Ig G抗体，1∶1000 稀释），室温培育2 h，暗室发光。以鼠抗人β-actin单克隆抗体（1∶1500稀释）作为内参照，Wnt10b 蛋白的相对表达量以Wnt10b／β-actin 灰度值比表示。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0 软件对数据进行统计学处理，癌组织与癌旁组织比较采用配对t检验，Wnt10b mRNA表达与临床病理参数间的比较采用两样本t检验，检验水准为α＝0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色鉴定组织病理特征 共收集标本33对，通过HE 染色，病理鉴定所有组织标本病理特征，高分化肝癌7 对，中分化肝癌17 对，低分化肝癌9 对，见图1。

图1 癌及癌旁组织病理学图片（HE ×200）

2.2 组织总R N A提取及实时定量P C R采用Trizol 法提取组织总RNA，取产物5μL 上样量于1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果可见18S 和28S 两条清晰条带，提示总RNA高质量提取成功。将RNA反转录后进行荧光定量PCR检测，通过荧光定量PCR扩增曲线，产物到达平台期，对融解曲线分析，可以看到单一的峰型，说明扩增产物有较高的特异性。PCR产物比较采用CT法定量，根据2-ΔΔCt值反映出Wnt10b 在不同样本的表达水平，见图2。

2.3 Wnt10b m RNA在肝癌及癌旁组织中的表达差异 将每个样品的2-△△CT值作为观察值，反映Wnt10bmRNA在33 对肝癌组织标本中的表达量，对Wnt10b mRNA在肝癌和癌旁组织中的2-△△CT进行配对t 检验，结果显示：Wnt10b mRNA在肝癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

图2 Wnt10b mRNA在肝癌及癌旁组织中的表达

2.4 Wnt10b 蛋白在肝癌及癌旁组织中的表达差异 Western blot 结果显示：肝癌组织中Wnt10b 蛋白表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。Wnt10b 和βactin 灰度值见图3。

2.5 肝癌组织中Wn t 10 bmRNA的表达与临床病理参数的关系 肝癌组织中Wnt10b mRNA的表达与患者的年龄、性别、组织分化程度及临床分期无关（P＞0.05），见表3。

表2 癌组织和癌旁组织中Wnt10b mRNA和 蛋白的表达（±s）

表2 癌组织和癌旁组织中Wnt10b mRNA和 蛋白的表达（±s）

a：P＜0.01，与癌旁组织比较。

组别 n mRNA 2-△△CT蛋白质癌组织 339.4441±7.6787a 0.2439±0.0826值a 335.3547±5.79050.1903±0.0936癌旁组织

图3 Western blot 检测Wnt10b 在肝癌及癌旁组织中蛋白的表达

表3 组织中Wnt10b 的表达与临床病理参数的比较（±s）

表3 组织中Wnt10b 的表达与临床病理参数的比较（±s）

P1：高分化组和中分化组比较；P2：中分化组和低分化组比较；P3高分化组和低分化组比较；P4：Ⅱ期和Ⅲ期比较；P5：Ⅲ期和Ⅳ期比较；P6：Ⅱ期和Ⅳ期比较。

项目 n Wnt10b mRNA 2-△△CT 值P 0.6703 男 229.0325±7.7348 女 1110.2672±7.8693年龄 0.9465 ＜60 岁 209.5181±8.5656 ≥60 岁 139.3301±6.4064分化程度 高 78.9668±8.54420.9730（P1） 中 179.0941±8.17660.6685（P2） 低 910.4763±6.76230.6986（P3）临床分期 Ⅱ 108.3789±5.86620.5679（P4） Ⅲ 1510.2817±8.18100.7207（P5） Ⅳ 89.0398±8.74130.8572（P6）性别

3 讨 论

Wnt 经典信号通路在调节组织器官的生成、增殖和分化，以及维持机体稳态中起重要作用［3］。经典Wnt 信号通路的构成和激活机制的研究已相对完善，人们认识到经典Wnt 信号通路并不仅是一条单纯的线性信号传导通路，而是一条多基因参与，拥有多个作用位点的相对开放的信号途径，参与该途径的蛋白及其作用机制相对复杂。Wnt 蛋白是Wnt 基因编码的分泌性蛋白，属于经典途径的有：Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b［2］。之前的研究表明Wnt 经典信号通路参与了消化系统肿瘤和女性生殖系统肿瘤的形成。研究证实，Wnt2 在食管细胞癌中通过激活经典信号通路，促进食管癌细胞的生长［4］；据报道，Wnt1［5］、Wnt2［6］在胃癌组织中异常表达。赵玉洁等［7］研究发现Wnt3a 在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织及宫颈鳞癌组织中的表达逐渐升高，可能参与了宫颈鳞状上皮的恶性转化过程，促进宫颈上皮内瘤变向宫颈鳞癌转化。另研究发现，Wnt10a 高表达时，肾癌细胞株的β连环蛋白（β-catenin）聚集、细胞周期素D1（cyclin D1）与禽类髓细胞病毒致癌基因同系物（c-myc）表达增加［8］，而当Wnt10b的表达被抑制后，细胞内的β-catenin 聚集减少，cyclin D1 与cmyc 表达下降，同时也导致细胞增殖、迁移、侵袭力等下降［9］。

研究表明，Wnt 经典信号通路各蛋白表达水平的改变及相关基因的突变参与了原发性肝癌的发生发展［10-12］。30%～70%的肝癌中发现Wnt 经典通路关键因子β-catenin 在胞内聚集［13］。Wei 等［14］发现Wnt1 在肝癌组织及其细胞系中表达增高，Wnt1 蛋白抗体能够降低肝癌细胞系Huh7 和Hep40 的增生及生存能力，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制经典Wnt 信号通路，而对正常肝细胞生长无影响。同样有研究认为Wnt1 可以作为一个重要指标预测肝癌术后复发［15］。Yoshikawa 等［16］发现7／10 的肝癌和1／2 的结肠癌细胞株表达大量的Wnt10b mRNA。Yuzugullu 等［2］研究发现在高分化和低分化的11 种肝癌细胞系中Wnt3 和Wnt10b 均表达上调。因此，Wnt10b 的异常表达参与了肝癌的发生，可能扮演着一个重要角色。本文从临床肝癌组织着手，运用荧光定量PCR技术和Western blot 技术，对肝癌组织中Wnt10b 基因转录和蛋白水平进行相对准确的定量检测和分析，敏感性和特异性较高。通过分析肝癌组织和癌旁组织中Wnt10b 基因和蛋白的表达变化规律，以研究Wnt10b 在肝癌发生发展中的作用。

研究结果示，Wnt10b mRNA及蛋白在肝癌组织中表达水平高于癌旁组织，研究结果与Yuzugullu 等［2］的一致，由结果可见Wnt10b 基因和蛋白表达趋势呈现出一致性，作者分析Wnt10b 表达的上调可能是在基因转录水平，而Wn t 10b 在肝癌组织的异常高表达提示，Wnt10b 可能在肝癌的发生发展过程中发挥着癌基因样的作用，在正常肝细胞向癌细胞转化过程中起着正向促进作用，而非抑制作用。而Wnt10b m RNA和蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度及临床分期无关，作者分析可能存在以下4 方面原因：（1）样本含量小、存在样本选择偏倚和信息偏倚；（2）以及RT-PCR和Western blot 结果出现假阳性；（3）人体组织中基因和蛋白表达的个体差异比较大；（4）肝癌的发生发展是一系列基因和蛋白的参与，存在着多种信息传导通路异常传导的病理过程，Wnt10b 对于肝癌不是一个绝对独立的因素，只是整个肝癌信号网络中的一个点。根据Wnt 信号通路的传导机制，Wn t 10b 在整个Wn t 信号通路传导过程中的启动阶段发挥重要作用，从Wnt10b 的异常表达到一系列靶基因的激活则可能受多种因子和信号通路的调节，而非简单的线性传导。作者认为，进一步研究Wnt10b 下游靶基因的作用机制，探明Wnt10b 介导的整条Wnt 信号通路中的各个环节以及寻找通路中抑制肿瘤细胞增殖的关键靶点十分重要。故本课题下一阶段将进行Wnt10b 在肝癌中下游靶基因的作用机制的研究，以及利用构建慢病毒载体和基因干扰技术探讨Wnt10b 基因沉默后对肝癌细胞株的影响。

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