大鼠面神经高位损伤后面神经核区磁共振波谱成像＊

李宗芳，张振光，龚霞蓉，田 伟，戴敏方，刘 流

（1.昆明医科大学第一附属医院磁共振室，昆明650032；2.云南省第一人民医院磁共振室，昆明650032；3.昆明医科大学第一附属医院口腔颌面外科，昆明650032）

研究表明面神经高位损伤可导致面神经元的显著凋亡［1-5］。以往研究凋亡采用的探测方法都为体外检测法，这些方法通常需要处死动物，而对人体内器官组织的凋亡研究则具有创伤性。作为一种无创性研究活体组织器官代谢物水平变化的影像学方法，质子磁共振波谱成像（proton magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS）为面神经损伤后面神经元细胞凋亡的无创性检测带来了希望。本研究通过对正常大鼠和面神经高位损伤大鼠模型行面神经核区1H-MRS成像，并对照组织病理学改变，以期探讨1H-MRS在面神经高位损伤后面神经元细胞凋亡的无创性检测中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠40只，对照组20只，实验组20只，体质量（200±10）g，由昆明医学院实验动物中心提供。分笼喂养于光照、黑暗均为12 h的恒温环境，自由摄食和饮水。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2 大鼠面神经高位损伤模型的建立 参照文献［4-5］，建立双侧面神经高位损伤模型，术后3 周行1H-MRS。具体方法：术前6 h 禁食，称体质量后后经腹腔注射4%水合氯醛（1 m L／100 g）进行全麻。麻醉生效后取俯卧位固定，耳后沟纵行切开皮肤约2 cm，于腮腺后上缘暴露面神经主干，沿主干向上稍追踪，在茎乳孔根部松解面神经并轻拉，使其被牵拉出约3 mm后切断，造成面神经高位损伤，断端脑侧自然回缩入茎乳孔。说明：本方法是双侧面神经高位切断。因为目前3.0T MRS虽在大鼠大脑可以做到单侧采集并自体对照，但在桥脑水平，由于桥脑本身体积较小且MRS 最小感兴趣区有限，在兼顾谱线质量的情况下，能达到的最小感兴趣区中桥脑双侧都会被包含在内，所以目前还做不到单侧采集，只有双侧高位切断面神经，并与正常大鼠进行对比。本文中波谱采集的感兴趣区可以从图1A、B 中左上角的感兴趣区定位图中看到。

1.3 面神经麻痹评价 面瘫的观察包括瞬目反射和触须运动［6］。瞬目反射的观察是用5 m L注射器18 号针头距离鼠眼3 cm瞬间吹风2 mL，比较双侧眨眼的速度和幅度进行评分：0分为双侧正常且对称、1 分为减弱或延缓、2 分为消失。触须运动的观察是通过比较双侧触须拂动的程度进行评分：0 分为双侧拂动正常且对称、1 分为触须拂动减弱、2 分为消失。将2 项指标的评分相加进行面瘫的鉴定和评价（0，1 分为无面瘫；2，3分为不完全面瘫；4 分为完全性面瘫）。

表1 对照组和实验组面神经核区的1H-MRS 代谢物值的比较（±s，n＝20）

表1 对照组和实验组面神经核区的1H-MRS 代谢物值的比较（±s，n＝20）

组别 NAA NAA／Cr Cho Cho／Cr对照组 10173．18 ±1500．331．27 ±0．146035．76 ±1357．420．76±0．19实验组 7840．00 ±2671．460．94 ±0．335514．50 ±1801．510．66 ±0．22 t 3．1593．7820．9621．418 P 0．0030．0010．3430．165

1.4 MRI 及1H-MRS 扫描 采用GE 3.0T超导M R扫描仪（Signa HDxt）及大鼠专用动物线圈。大鼠经腹腔注射4%水合氯醛（1 mL／100 g）麻醉后，俯卧位固定。

常规MRI 扫描：采用快速自旋回波（fast spin echo，FSE）的T2WI 序列，以桥脑为中心进行轴位、矢位及冠位的扫描，目的是为1 H-MRS扫描提供定位像。扫描参数为：TR／TE：1140 ms／110 ms，视野：8.0 cm ×5.6cm，矩阵：320 ×256，激励次数：3，层厚／间隔：2.0 mm／0.3 mm，回波链：10。

1 H-MRS 扫描：依据大鼠脑立体定位图谱［7］，以第四脑室尖所对桥脑平面为中心（面神经核团最大层面），选择1 感兴趣区，取感兴趣区时尽量避开周围骨质、血管及脑脊液等，并在其周围使用选择性饱和带。用点分辨波谱序列（point-resolved surface coil spectroscopy，PRESS），对所选择的感兴趣区自动完成体素内匀场、抑水，达到理想标准后开始1H-MRS 扫描。PRESS 序列参数：TR／TE：1000ms／144ms，矩阵：12 ×12，激励次数：5，FOV：10 cm，扫描时间12 分4 秒。原始数据传入工作站后使用Functool 4.5.5 软件进行处理。在重建的波谱图上，获得波谱分析软件自动计算出的各代谢物的值，包括N-乙酰天门冬氨酸（N-acetylaspartate，NAA）、胆碱（choline，Cho）、Cho，并以Cr 值为标准，计算NAA／Cr 和Cho／Cr 的值。

1.5 对照组与实验组组大鼠面神经核的苏木素-伊红（HE）、甲胺苯蓝（TB）和末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP 原位切口末端标记（TUNEL）染色 于MR检查后取对照组2 只与实验组4 只大鼠行灌注、取材和切片。切片时取面神经根与副神经根之间脑干，依据大鼠脑立体定位图谱［7］定位面神经核位置，然后以5μm层厚连续切片，每5 张取1 张切片进行贴片。共收集3 套切片，分别行HE、TB 和TUNEL 染色。

1.6 统计学处理 采用SPSS17.0 软件进行数据分析。计量资料以±s表示，2 组大鼠面神经核团脑组织的NAA、Cho、NAA／Cr 及Cho／Cr 指标之间的比较采用两独立样本均数t 检验进行统计处理，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 面神经损伤大鼠模型的行为学观察 术后所有动物进食、活动正常。术后1～3 周双侧触须均集中伸直并向后伸展，完全不能抖动，瞬目反射消失，呈现完全性面瘫，证实造模成功。

2.2 1H-MRS 检测结果 实验组NAA、NAA／Cr 较对照组降低且差异有统计学意义（P＜0.05），而Cho 及Cho／Cr 差异无统计学意义（P＞0.05），见表1，图1、2。

图1 2组1H-MRS 的感兴趣区定位图及波谱图

图2 2组面神经核病理学染色图（×100）

2.3 2组大鼠面神经核的HE、TB 和TUNEL 染色 对照组，HE 染色：正常面神经元胞核呈淡紫色，细胞质为深紫色，神经元周围分布着胶质细胞。TB 染色：与HE 染色比较，由于胶质细胞染色浅淡，面神经元染色更为明显；高倍镜下正常面神经元胞核呈淡蓝色，核仁明显、居中呈紫蓝色，细胞质中尼氏体染色均匀呈紫蓝色。TUNEL染色：正常面神经元胞核呈淡棕色，核仁和细胞质均为淡绿色，TUNEL阳性细胞为棕褐色，即凋亡细胞。由图可知对照组大鼠面神经核中没有或偶见单个凋亡细胞，见图2A、B、C。实验组，HE染色：大量神经元表现为细胞固缩，胞体收缩，呈类三角形，胞核收缩呈不规则形状。没有发现红色神经元、鬼影细胞、卫星现象等神经元坏死的特异性改变，因此可以排除细胞坏死。TB 染色：大量神经元表现为细胞固缩，胞体收缩，呈类三角形，胞核收缩呈不规则形状。TUNEL 染色：面神经核中见大量阳性细胞，见图2A1、B1、C1。

3 讨 论

3.1 面神经高位损伤后面神经元的凋亡 文献报道，当面神经高位损伤后其胞体从靶器官获取的神经营养因子减少，出现形态改变，并不可避免地引起一定数量的神经元细胞死亡，且其死亡方式以凋亡为主。Dai 等［2］、方泽强等［3］对大鼠面神经损伤后面神经核内神经元的变化进行了研究，认为面神经损伤后面神经核内的神经元在15 d 达到凋亡高峰。Park 等［4］对小鼠面神经高位损伤4 周时面神经核内神经元的数量进行了计数，研究认为损伤侧的面神经核内神经元的数量仅有正常侧的10%。而本实验前期研究认为，面神经高位损伤后面神经核内的神经元在第3 周时较第2 周明显［5］，所以本实验选择在造模后3 周行1H-MRS。

3.2 MR扫描仪在大鼠1 H-MRS 研究方面的应用 MRS 是1 种利用化学位移现象对特定原子核及化合物进行定量分析的功能性成像技术，在临床症状出现之前即可早期无创伤性地测量活体脑组织内化合物的代谢变化。1H-MRS对NAA、Cho、Cr 这3 种化合物浓度的测量具有很好的可重复性和稳定性，可通过这些化合物浓度的变化反映脑内一些疾病的病理变化。由于大鼠的体质量相对于人体很小，需要更高的空间分辨率及信噪比，所以大鼠脑的1 H-MRS 在以往多使用4.7T及其以上场强的非临床型MR扫描仪进行研究，国内外已有很多报导［8-11］。但随着近年来1.5T及3.0T MR扫描仪在临 床 上的推广及软硬件的提高，越来越多的研究者尝试在临床型MR扫描仪上进行大鼠动物模型的1H-MRS 研究。Dogan 等［12］在1.5TMR扫描仪上用1 H-MRS 技术来研究3G手机的电磁辐射对大鼠大脑的影响。Leib 等［13］在2.34T MR扫描仪上用1H-MRS 技术来研究丙戊酸盐体内注射后活体大鼠脑内丙戊酸盐的检测。Ma 等［14］用1H-MRS 技术来研究在体和离体偏头痛大鼠模型脑内代谢物浓度的变化，其中在体研究使用3.0T MR 扫描仪，离体研究使用14.7T MR扫描仪，二者的结果一致。上述研究证明在临床型MR仪上用1H-MRS 技术无创性检测一些大鼠模型脑内代谢物的变化是可行的，所以本实验尝试用3.0T MR扫描仪来研究1H-MRS 在面神经高位损伤后面神经元凋亡的无创性检测中的应用价值，以期为将来的临床应用奠定基础。

3.3 NAA峰值的变化及意义 N A A是正常波谱中的最高峰，位于2.02 ppm处。NAA主要在中枢神经系统的神经元中出现，而不出现在神经胶质细胞或者是非神经细胞组织中，是神经元及其附属物的特异性标记物，被称为神经元的内标记物。NAA的含量可反映脑内神经元的数量、功能和神经元的完整性，在神经元丧失或者是受损时，其浓度下降。在1H-MRS 中，NAA含量或与其他代谢物的比值的减低，可作为神经元数量缺少和功能障碍的最佳指标［15］。Woo等［10］应用1 H-MRS 技术研究大鼠脑缺血模型脑内代谢物的变化，发现NAA／Cr 值在缺血再灌注后9h 时出现降低，同时TUNEL阳性细胞数量出现明显增多。赵光明等［16］对三叉神经慢性疼痛的大鼠模型双侧丘脑进行1H-MRS 检测，慢性疼痛致模型组丘脑区NAA／Cr 值较假手术组减少，表明1H-MRS 可以检测出慢性疼痛状态下丘脑神经元的受损情况。本实验实验组NAA、NAA／Cr 值较对照组降低，提示实验组面神经核区神经元的含量较对照组减少，同时行为学检测显示大鼠呈完全性面瘫，病理学显示面神经核中大量TUNEL阳性细胞，表明1HMRS 的检测结果与行为学表现和病理学结果一致，提示1HMRS 可以作为一种无创性评价面神经损伤后面神经核区神经元细胞凋亡的方法。

3.4 Cho 峰值的变化及意义 Cho 的波峰位于3.2 ppm处，是细胞膜磷脂代谢的主要成分之一，反映细胞膜的更新。Cho反映脑内总胆碱的储藏量，包括游离胆碱、磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和磷酸甘油胆碱等。Cho 与细胞膜磷脂的分解和合成有关，可反映细胞膜的稳定性和神经胶质的增生。Cho 峰增高提示细胞分裂增殖活跃，以及细胞膜代谢异常增高［17］。本实验中对照组与实验组Cho、Cho／Cr 比较差异无统计学意义（P＞0.05），这可能是因为面神经核区神经元细胞凋亡的同时，有大量的胶质细胞增生，抵消了神经元细胞凋亡引起的Cho 量的减少，从而导致Cho、Cho／Cr 无明显变化［3］。关于Cho／Cr 的变化，目前未有明确的理论解释，尚需进一步研究探讨。

综上，本研究应用1H-MRS 技术在大鼠活体上无创检测了面神经损伤后面神经核区NAA、Cho、Cr 等物质的代谢改变，并与行为学表现及病理学检测结果一致，提示1H-MRS 可以作为1 种无创性评价面神经损伤后面神经核区神经元细胞凋亡的方法，为将来的临床应用奠定了基础。

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