油桐异质型乙酰辅酶A羧化酶accA亚基全长cDNA克隆及序列分析

王 哲 ，谭晓风 ，龙洪旭 ，陈 昊

（中南林业科技大学a.经济林培育与保护教育部重点实验室；b.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004）

油桐Vernicia fordii属大戟科Euphorbiaceae油桐属Vernicia，原产于中国，是我国特有的经济林木，与油茶、核桃、乌桕并称为我国四大木本油料植物[1]。桐油是优质干性油，具有干燥快、光泽度高、附着力强、绝缘性能好、耐酸耐碱、防腐防锈等优良性能[2]，是制造涂料和油漆的重要生产原料，也是制造生物柴油和改性高分子材料的优质原料。

油脂的合成是从乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A开始的[3]，丙二酰辅酶A是脂肪酸合成和脂酰链延伸系统等重要代谢的底物[4]，是脂肪酸合成中C2单位的供体，并且在脂肪酸氧化反应中起到调节线粒体穿梭系统的作用[5]，乙酰辅酶A羧化酶被认定为生物体内的一个基本代谢底物和特定蛋白活性的调控因子[6]。所以，乙酰辅酶A羧化酶催化反应不仅是第一和关键的步骤，同时也是限速步骤[7]。

ACCase在结构上有3个功能域，分别是生物素羧化酶(biotin carboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein, BCCP)、羧基转移酶(Carboxyl transferase, CT)。生物素以共价键连接在BCCP亚基上，在ACCase羧化乙酰CoA的过程中，其为羧基的中间载体。BC和CT各催化如下2个独立的半反应，BCCP则作为活化羧基的供体，在BC和CT之间摆动以传递羧基。

（1） BCCP＋ HCO3－＋Mg2＋－ATP→BCCP－CO2－＋Mg2＋－ADP＋Pi:Biotin carboxylase；

（2） BCCP－CO2－＋乙酰－CoA→BCCP＋丙二酰－CoA: Carboxyl transferase。

在自然界中，发现有异质型和同质型两种在生理上有很大差别的ACCase形式[8]；而在植物体内则有异质型和同质型两种类型的ACCase，其分别位于质体和胞质溶胶中[9]。

异质型ACCase，也称为多亚基或原核型ACCase，存在于细菌及双子叶植物和非禾本科单子叶植物的质体中[10-11]。异质型ACCase包含了4个亚基，即生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）、生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein，BCCP）及羧基转移酶（carboxyl transferase，CT）的 α-CT和 β-CT这2个亚基，其中前2个亚基组成BC和BCCP域，后2个亚基构成CT催化域。在有活性的状态下，异质型ACCase的BC和BCCP亚基呈现同型二聚体，而α-CT和β-CT亚基呈现异型二聚体。异质型ACCase不稳定，容易解离。

同质型ACCase，亦称为多功能或真核型ACCase，存在于动物、酵母、藻类及植物的胞质溶胶中，具有一个分子量为220～260 kDa的生物素包含亚基。这类单亚基ACCase含有3个功能域，在序列上对应于异质型ACCase的BC、BCCP、α-CT和β-CT组分，但与异质型ACCase不同，同质型ACCase的3个功能域融合成一条多肽链，结构上更为稳定而难以解离。不同生物来源的同质型ACCase具有相同的组织结构形式，即NH2-BCBCCP-CT-COOH。

ACCase与植物种子的含油量密切相关。Gengenbach等人[2]在以黄豆为材料的研究中发现，从发育早期到中期，高油黄豆ACCase的活性比低油黄豆高2倍。由此推断，在种子的早期发育过程中，ACCase基因表达量的增加与种子成熟时含油总量的增加具有相关性。因此，在植物体内过量表达的ACCase有可能导致植株和种子含油量的增加。Ohlrogge等人[12]将油菜种子贮藏蛋白napin特异性表达启动子连接到拟南芥同质型ACCase基因上，将其转入油菜中，结果获得的转基因植株T1代成熟种子的ACCase活性比对照增加了1.7～1.9倍，脂肪酸含量增加了6%，而T2代的脂肪酸含量则增加了5.0%～6.4%。Sellwood等人[13]利用反义表达技术抑制油菜同质型ACCase的活性，结果获得的转基因植株其成熟种子的含油量显著低于对照。油桐是我国特有的油料植物，开展乙酰辅酶A羧化酶质体工程的研究，具有重要的理论意义和现实意义。因此，克隆与分析羧基转移酶α亚基的cNDA基因是十分必要的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用的油桐近成熟种子来自于湖南省永顺县青坪镇中南林业科技大学永顺实验基地——国家油桐种质资源保存库。2012年8月底采集葡萄桐近成熟种子为实验材料，保存于－80 ℃的冰箱中以备用。

大肠杆菌Trans-T1感受态细胞、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix 均购自北京全式金生物技术有限公司，PureLinkTM RNA Mini Kit购自英潍捷基（上海）生物技术有限公司，高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase、100 bp 的 Plus DNA Ladder购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。无水乙醇、异丙醇等均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 油桐种子总RNA的提取和cDNA的合成

油桐种子总RNA的提取，参照英潍捷基生物技术有限公司的PureLinkTM RNA Mini Kit试剂盒中说明的方法进行。以琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的提取效果。采用宝生物工程有限公司的cDNA合成试剂盒，参照试剂盒中的说明方法，得到第一链cDNA。

1.2.2 油桐ACCase基因α亚基的克隆

从油桐转录组测序结果中获得了α-CT亚基的全长序列，其开放阅读框长为2313 bp。利用Primer Premier 5软件设计的上游引物（AF1）5'-ATGGCTTCTGTATCGCATTCTC-3 '和下游引物（AR1）5'-TAAATATCTAAGCAAAGCTGCGGTT-3'，以葡萄桐近成熟种子反转录的单链cDNA为模板，进行了PCR扩增。PCR反应体系（20 μL）为：5×Preme STAR Buffer（Mg2+）4 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，上游、下游引物（10 μmol）各 0.4 μL，模板 cNDA 0.4 μL，Prime STAR HS 0.2 μL，dH2O 13 μL。扩增条件为：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60.2 ℃、30 s，72 ℃、150 s，30 个循环；72 ℃、10 min；4 ℃Forever。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，再将回收产物与pEASYBlunt Simple载体连接起来，并转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，将其均匀地涂抹在含有氨苄青霉素的LB平板上，于37 ℃下培养8 h，挑取单菌落，37 ℃下摇菌过夜。对菌液作PCR检测，将阳性结果送至北京六合华大基因公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析

用NCBI的BLAST功能（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索同源的核苷酸序列及氨基酸序列；用DNAman软件将accA亚基与其它物种的氨基酸进行比对，并用clustalx和MEGA4.0软件构建accA的系统进化树；用在线软件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）计算accA的分子量、等电点、分子式、不稳定系数、脂肪系数；用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）检测信号肽序列；用在线软件protscale（http://expasy.org/tools/protscale.html） 分析accA的疏水性；用在线软件TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）进行跨膜结构的预测；用在线软件SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测蛋白质二级结构；用ESyPred3D Web Server 1.0（http://webapps.fundp.ac.be/esypred/）预测蛋白质三级结构。

2 结果与分析

2.1 目的基因全长cDNA的克隆

以葡萄桐近成熟种子反转录的单链cDNA为模板，用特异性引物（AF1、AR1）进行扩增，将回收的目的片段连接到pEASY-Blunt Simple上，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，用PCR检测后获得了阳性克隆，最后进行测序。最终确认为：accA的cDNA序列全长为2 313 bp，其编码770个氨基酸，命名为VfCTα，GenBank登录号为KF964574。总RNA的电泳结果见图1，PCR扩增结果见图2。

图1 总RNA的电泳结果Fig. 1 Electrophoresis result of total RNA

图2 油桐accA基因的PCR扩增结果Fig. 2 PCR amplification result of accA gene in V. fordii

2.2 accA亚基序列的生物信息学分析

2.2.1 accA核苷酸序列分析结果

对accA的全长cDNA测序结果进行分析，结果发现，测序结果与油桐转录组ACCase基因的accA亚基完全吻合，CDS长2 313 bp，其编码770个氨基酸。将accA亚基CDS序列与NCBI中的 Blastn进行比对，结果见表1。由表1可知，accA亚基核苷酸序列与麻疯树的相似度最高，达到90%，其与蓖麻、大叶杨、甜橙、葡萄、陆地棉等物种的相似度分别为88%、82%、80%、80%、78%。

表1 油桐accA全长cDNA序列的Blastn结果Table 1 Blast result of full-length cDNA of accA in Vernicia fordii

2.2.2 accA蛋白氨基酸序列同源性及系统进化分析结果

运用Primer5.0软件将cDNA序列翻译成氨基酸序列，结果得到了770个氨基酸。用DNAman软件将accA蛋白的氨基酸与其它9个物种的氨基酸序列进行多序列比对，结果如图3所示。图3表明：它与麻疯树的氨基酸同源性最高，可达90%，其次是蓖麻，为87%；它与可可、杨树、陆地棉、葡萄、甜椒、番茄、黄瓜的同源性分别为76%、76%、72%、73%、69%、69%、68%。由图3可知，不同物种accA亚基的相似性较高，N端的保守性很强，C端的保守性很弱。

图3 油桐与其它物种的accA蛋白质序列的比对结果Fig. 3 Alignment of accA protein sequences in V. fordii and other species

对这几个氨基酸序列进行深入的系统进化分析，用clustalx和MEGA4.0软件构建accA亚基的进化树，结果如图4所示。从图4中可以看出，油桐与麻疯树最先聚合，然后与蓖麻聚合，再与葡萄、番茄甜椒聚合，而与可可、杨树、陆地棉、黄瓜的进化关系较远。在进化树上最先聚合的是亲缘关系较近的物种，油桐与麻疯树、蓖麻同属于大戟科，相对而言，其与上述其它物种的遗传距离应该也是最近的。

图4 accA蛋白质系统进化树Fig. 4 Phylogenetic tree of accA protein

2.2.3 accA蛋白质特性及亲水性的预测结果

用在线软件ProtParam对accA蛋白质的理化性质进行了分析，结果（如图4）表明：accA蛋白质分子量为85 902.7 Da；其理论等电点为8.48，其中负电荷氨基酸残基（Asp＋Glu）数目为113，正电荷氨基酸残基（Arg＋Lys）数目为118；其分子式可写为C3798H6156N1044O1158S29；在280 nm下测定的光吸收值为0.403；该蛋白在大肠杆菌中的半衰期大于10 h；其不稳定系数为37.33，被划分为不稳定蛋白；其脂肪系数为83.16。对提交于SignalP 4.1 Server网站的accA氨基酸序列进行了信号肽预测，结果表明：accA中不存在信号肽切割位点，是一个非分泌蛋白。

用在线软件protscale对accA进行了亲水性分析，结果如图5所示。由图5可知，其亲水指数为－0.510。对亲环素蛋白的疏水性也进行了在线分析，结果如图5所示。由图5还可知，该蛋白的疏水指数从－3.044 至2.589，约在第189、282位表现出较强的疏水性，在第58、208、747、752位表现出较强的亲水性。

图5 油桐accA蛋白质疏水性分析结果Fig. 5 Analysis result of hydrophobicity of accA protein in V. fordii

2.2.4 accA亚基氨基酸跨膜结构预测及功能域确定

将accA的氨基酸序列提交到Tmpred网站，对accA的跨膜结构进行了预测，结果如图6所示。图6表明：该蛋白有4个比较明显的跨膜区，即第273～299、302～323位氨基酸的跨膜区，其跨膜方向由内向外，另外两个由外向内的跨膜区位于第293～306和302～323位氨基酸。

采用同样的方法，将accA氨基酸序列与SMART网站的数据库进行了比对，找出了相应的功能结构域。第92～236位氨基酸是ACCA功能域；第160～389位氨基酸为羧基转移酶域。而第431～442、446～460、715～730、741～757位氨基酸则是复杂性弱的序列。

2.2.5 accA蛋白质二级结构和三级结构的预测结果

图6 Tmpred对油桐accA跨膜区的预测结果Fig. 6 Tmpred prediction result of transmembrane domain in accA of V. fordii

在SOPMA网站预测的accA蛋白质中，α螺旋结构（438AA）占56.88%，延伸主链（69AA）占8.96%，β折叠（37AA）占4.81%，无规则卷曲（226）占29.35%。这一结果说明，accA基因编码的蛋白质主要以α螺旋结构为主，间或为无规则卷曲和延伸主链。

为了预测accA蛋白质的三级结构，必须先找到对应模板。SWISS-Model是一个在已知大分子结构的基础上的分子模建自动服务系统，用相似性在30%以上且结构已知的蛋白质来建立未知结构的蛋白质分子模型。在SWISS-MODEL中找到了金黄色酿脓葡萄球菌(编号为2f9iA)的accA蛋白，其与油桐accA蛋白的三级结构最为相似，其中第89～406位氨基酸与2f9iA的相似度最高，相似度达到48%，故以此作为预测accA蛋白质三级结构的模板。在ESyPred3D中提交accA氨基酸序列和参考模板（2f9iA），得到油桐accA蛋白质的三级结构（如图7a）。从图7a中可以看出，accA中有14个α螺旋。accA蛋白大致可以分为2个部分（如图7b所示），一个是呈球体的主体，另一个是连接着主体的延伸部分，结合accA蛋白所起到的转移羧基作用，此延伸部分应该与accD蛋白结合形成CT功能域有关。

图7 油桐accA蛋白质三维结构模型Fig. 7 Three-dimensional structure of accA protein in V. fordii

3 结论与讨论

乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）是催化种子脂肪酸生物合成的第一步，也是最关键的限速步骤。有关研究结果表明，ACCase的BC、BCCP、β-CT、α-CT亚基中任何一个亚基的基因超量表达均可提高种子的含油率[8,12,14-15]。植物体内异质型ACCase的BC、BCCP和α-CT三个亚基都是由核基因组编码的，在N端都具有转移肽序列，它们表达的前体蛋白被运送到叶绿体中，除去转移肽后，就组装成了具有ACCase催化活性的高分子量的复合体[16]。在细胞质中α-CT亚基所表达的前体蛋白被运送到叶绿体中，与β-CT亚基所表达的蛋白结合，形成ACCase三大结构功能域之一的羧基转移酶（CT）。在不同物种accA蛋白氨基酸的多重比对中发现，所有accA所编码的氨基酸都包含了ACCA功能域，该功能域位于accA保守区域内，可以作为判断accA亚基的标志。而油桐accA亚基所编码的氨基酸同样含有ACCA功能域，位于第92～236位氨基酸。此次克隆的cDNA序列，通过网上比对，可确定为油桐ACCase的accA亚基，将其命名为VfCTα，并将accA亚基的核苷酸序列及其氨基酸序列登陆到GenBank，登录号为KF964574。accA是组成乙酰辅酶A羧化酶4个亚基中的一个亚基，其本身并没有活性，而且无法检测其酶活性，在其体内该酶与羧基转移酶β亚基（accD）一起形成异源二聚体，即羧基转移酶（CT），羧基转移酶与生物素羧化酶（BC）和生物素羧基载体蛋白（BCCP）一起构成乙酰辅酶A羧化酶这个多酶复合体，才能发挥该酶的作用。VfCTα的全长cDNA的确定，蛋白质的生物信息学分析和理化性质分析及二、三级结构的预测，为以后油桐ACCase基因的研究提供了理论依据，也为油桐accA亚基的表达及其对ACCase活性的影响提供了物质条件，为油桐的分子育种奠定了基础。

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