雌性榧树4个居群遗传多样的SRAP分析

刘浩凯，胡树恒 ，董雷鸣，张 辉，曾燕如，喻卫武，戴文圣

（1.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300；2.浙江省临安市森林资源保护管理总站，浙江 临安 311300）

榧树Torreya grandisFort. ex Lindl.隶属于红豆杉科Taxaceae榧属Torreya，雌雄异株，为第三纪孑遗植物，分布于江苏南部、浙江、福建北部、江西北部、安徽南部，南至湖南西南部及贵州松桃等[1]中亚热带和北亚热带地区[2]。香榧T.grandis‘Merrilli’是榧树的一个优良自然变异类型经无性繁殖培育而成的栽培类型，也是迄今为止榧树这个种乃至榧属中唯一一个商品化生产的栽培类型，其生产上的授粉树是雄性榧树。

由于香榧具有很高的经济价值，相关的研究报道较多。随着对榧树资源认识的加深及分子标记技术的发展，研究人员先后采用AFLP（扩增片段长度多态）[3-5]、ISSR（简单重复序列区间扩增）[5-7]、RAPD（随机扩增多态DNA）[8-9]标记对包括香榧在内的榧树开展了研究，但所有这些标记均为显性标记，至今尚无适用于榧树群体遗传研究的共显性标记的报道。沈登锋率先建立了适用于榧树的SRAP（序列相关扩增多态性）标记分析体系，并利用该标记对榧树的种质资源及生长快速的野生榧树种质开展了研究[7]。在这些标记中，相比AFLP操作的复杂性，RAPD、ISSR、SRAP标记的操作要简单得多，但SRAP不同于RAPD、ISSR标记，可显示大量的共显性[10-11]。

香榧的存在已有千年，在长期无性繁殖过程中不可避免地出现了分化。因此，品种改良和创新势在必行，而品种改良和创新均必须以丰富的种质资源为基础。此外，实生榧树种内性状变异极其复杂，丰富的基因资源是创新品种的遗传基础。因此，在分子水平上研究雌性榧树的遗传多样性具有重要的选育种价值。基于SRAP标记的雌性榧树遗传多样性研究尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料为榧树的嫩叶，采自榧树主要分布区安徽省黄山市小荣村（29个样品）和樵山村（24个样品），浙江省淳安县临岐镇朱塔村（22个样品），临安市太湖源村（11个样品）的天然榧树群体（见图1），样株之间彼此至少相距100 m，共86个雌株样品。榧树嫩叶采集后放入带有硅胶的自封袋中，带回实验室后置于－40 ℃冰箱贮存，用于后续基因组DNA的提取。

图1 4个雌性榧树居群的地理位置Fig. 1 Geographic distribution of 4 populations of T. grandis

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

在DNA提取过程中，样品的研磨采用冷冻混合球磨仪（MM400，德国Retsch），震动频率设置为30 Hz，震动研磨时间设置为40 s。样品研磨后参照沈登锋的改良CTAB法提取榧树嫩叶DNA[7]，提取的DNA用分光光度计（NanoDrop，ND-100） 测 定 DNA浓 度、OD260值、OD280值及其比值，并用1%琼脂糖凝胶150 V电泳，电泳结果在AlphaImager成像系统（Alpha Innotech Corporation, USA）中拍照贮存。

1.2.2 SRAP-PCR扩增

SRAP-PCR扩增体系及程序在沈登锋建立的SRAP反应分析体系[7]基础上进行改进，改进后的反应体系为：模板DNA（10 ng·μL－1）2 μL，MgCl2（25 mmol·L－1）1.76 μL，Taq 酶（5 U·μL－1，上海申能博彩生物科技有限公司）0.2 μL，上下游引物（10 μmol·L－1）各 0.4 μL，dNTPs（10 mmol·L－1，生工生物工程 (上海 )股份有限公司）0.72 μL，10×PCR buffer 2 μL，ddH2O 12.52 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；共5个循环，每个循环94 ℃变性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；随后35个循环，每个循环94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保持。

在本试验中，PCR扩增产物的电泳摒弃了原琼脂糖凝胶电泳的方法，采用8%[Acr（丙烯酰胺）︰Bis（甲叉丙烯酰胺）＝29︰1]非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE），在180 V恒定电压下，于DYCZ-30C电泳仪（北京市六一仪器厂）中电泳70 min，然后进行银染、拍照。参照郭大龙等的方法[12]，电泳胶的银染仅采用了银染及显影步骤，同时银染液（0.15% AgNO3＋10%乙醇）未采用甲醛，而采用乙醇；显影液（20% NaOH＋0.4%甲醛）中用强碱（200 g·L－1NaOH）取代了Na2CO3溶液，省去了固定和定影2个步骤。

1.2.3 引物筛选

Li和Quiros[11]报道了SRAP 10对正向引物及10对反向引物共100对引物组合。基于此，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，并用4个榧树基因组DNA进行筛选，最后用经过筛选的引物对样品进行分析。

1.2.4 数据统计与分析

样品DNA SRAP分析结果中有扩增位点的读成1，反之读成0，形成0/1原始矩阵。参考Smith[13]等的方法计算多态信息含量（PIC）值。应用POPGENE Version 1.31软件[14]，在假定种群处于哈迪-温伯格平衡前提下，对标记数据进行遗传参数分析。应用AMOVA（Analysis of Molecular Variance）1.55[15]进行分子方差分析，计算遗传变异在居群间和居群内的分布。对居群遗传距离与地理距离的相关性进行Mantel检验[16]。运用NTSYS 2.1软件，基于Nei’s遗传一致度，对4个雌性榧树居群进行UPGMA聚类分析。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取

使用冷冻混合球磨仪研磨样品的效率较高，提取的基因组DNA与手工研磨的效果相当，2个波长的光密度比值OD260/OD280可达到1.8～2.0，且琼脂糖凝胶检测结果显示提取的DNA条带明亮，可用于后续的标记分析。

2.2 SRAP-PCR扩增的多态性

SRAP引物经筛选，有26对引物组合F1R9、F2R1、F2R6、F2R10、F3R1、F3R9、F4R9 、F5R4、F5R5、F5R9、F5R10、F6R2、F6R4、F6R8、F7R2、F7R9、F7R10、F8R1、F9R2、F9R3、F9R4、F9R5、F10R2、F10R4、F10R6、F10R7能够扩增出清晰、多态且可重复的条带，用于研究样品的SRAP分析。结果共扩增产生了404个位点，其中多态位点330个，平均每对引物扩增出了12.69个多态位点，多态性位点的比率（PPL）为83.79%；扩增位点数最多的引物组合是F10R7，扩增出了20个位点；扩增位点数最少的引物组合是F6R4、F7R10和F10R2，扩增位点数均为8个（见图2和表1）。26对引物组合的平均多态信息含量（PIC）值为0.294 3，F7R2具有最高的PIC值（0.410 7），F9R3具有最低的PIC值（0.215 9）。

表1 SRAP引物组合及扩增结果Table 1 Primer pairs of SRAP and amplification result

图2 引物对F5R5扩增产物电泳结果Fig. 2 Electrophoresis result of sample DNAs amplified with F5R5 primer pair

2.3 雌性榧树居群的遗传多样性

Popgene 32分析结果表明，雌性榧树在物种水平上，多态位点的比率（PPL）为81.68%。观察的等位基因数（Na）为2，有效等位基因数（Ne）为 1.484 6，Nei’s基因多样性（H）为 0.294 9，Shannon信息指数（I）高于H，为0.454 5（见表2），物种内多样性较丰富。由H估算的雌性榧树总遗传多样性（Ht）为0.288 0。

在居群水平上，各居群间PPL存在着较大的差异，其中小荣居群最高，为93.64%，其次是樵山和朱塔居群，分别为92.42%、91.52%，最低的是太湖源居群，为57.58%，平均83.79%，略高于物种水平，而Na、Ne、H、I均略低于物种水平（见表2）。4个雌性榧树居群总的基因多样度（Ht）为0.288 0，居群内基因多样性（Hs）为0.256 6。各居群Nei’s基因多样性（H）在0.182 0～0.290 8之间；Shannon（I）指数在0.277 3～0.441 8之间，各居群的Shannon信息指数与Nei’s基因多样性指数变化趋势基本一致，但也是I高于H。以多样性指数为评价指标，则樵山居群的遗传多样性最高（H＝0.290 8，I＝0.441 8），太湖源居群遗传多样性最低（H＝0.182 0，I＝0.277 3）（见表2）。

表2 雌性榧树物种水平及各居群内的遗传多样性Table 2 Genetic diversity in female T. grandis at population and species levels

2.4 雌性榧树居群的遗传变异来源

Popgene 32分析结果表明，居群间基因分化系数（Gst）为0.108 9，表明大多数遗传变异存在于居群内，即变异居群内占89.11%，而居群间仅占10.89%。通过Gst计算出的居群间的基因流Nm[Nm＝0.5(1－Gst)/Gst]为4.090 9，表明居群间每代进行有效基因交流数为4个左右，低于异交、风媒植物基因流的平均水平（Nm＝5.380）[17]。尽管雌性榧树居群内遗传多样性大于居群间，但居群间存在基因流。

AMOVA方差分析结果表明（见表3），雌性榧树居群总的遗传变异中，居群间占8.01%，91.99%的遗传变异发生在居群内，结果与Popgene 32的分析结果接近，也说明雌性榧树居群内的变异远大于居群间，即遗传变异主要分布在居群内。

表3 雌性榧树居群SRAP分子标记位点频率的方差分析（AMOVA）†Table 3 AMOVA of locus frequency expressed by SRAP molecular markers for four populations in female T. grandis

2.5 雌性榧树居群间的遗传距离及聚类分析

Popgene 32 分析结果（见表4）表明，4个雌性榧树居群两两间的Nei’s遗传相似性在0.922 5～0.974 7之间，平均为0.953 7；遗传距离（D）的变化范围为0.025 6～0.080 6，平均遗传距离为0.047 6。用Mantel的方法来检测遗传距离与地理距离之间的关系，结果表明基于SRAP的遗传距离和地理距离之间的相关性不显著（r＝0.683 7，p＝1.000 0）。

根据Popgene 32分析的雌性榧树居群间的Nei’s遗传一致度，对4个雌性榧树居群进行UPGMA聚类（见图3）。结果表明小荣和朱塔2个居群的遗传距离最小（D＝0.025 6），遗传相似度最高（0.974 7），先聚在一起，然后再与樵山居群聚在一起，最后与太湖源居群聚集在一起。总的来说，4个居群彼此之间的遗传距离相差不大。

表4 雌性榧树4个居群的遗传相似性和遗传距离†Table 4 Nei’s genetic identities and genetic distances between four populations in female T. grandis

图3 雌性榧树4个居群遗传关系的UPGMA聚类Fig. 3 UPGMA Phylogenetic clustering of four populations in female T. grandis

3 结论与讨论

SRAP标记是基于其它DNA分子标记技术的优缺点上发展起来的新的分子标记技术[18]。它根据基因外显子里GC碱基含量丰富和内含子、启动子里AT碱基含量丰富来设计引物进行DNA扩增，其应用前景广泛，但在应用上的体系优化不容忽视[19-21]。本研究中利用SRAP分子标记技术对4个天然雌性榧树居群的遗传多样性和遗传分化进行了分析，结果显示，榧树在物种水平和居群水平上的遗传多样性均较高，且雌性榧树居群的遗传多样性主要存在于居群内（91.99%），居群内的遗传差变异明显大于居群间，与Hamrick[17]等对异交风媒植物的研究结果类似。

基因流是影响居群内部和居群间遗传变异程度的重要因素[22]。遗传结构是通过物种居群内和居群间遗传分化来体现的，基因流的大小也可以反映居群遗传结构变异的大小。一般来说，基因流大的物种，居群间遗传分化小[23]，反之，居群间的遗传分化大[24]。Wrigh[25]认为，当Nm＞1时，说明居群间存在一定的基因流动。本研究中雌性榧树Nm＝4.090 9＞1，从一个侧面反映了榧树居群间遗传分化较小的原因，这与榧树风媒传粉的特性相符。4个居群UPGMA聚类的结果也证实了这一点。此外，雌性榧树地理分布所产生的地理隔离对遗传分化没有显著的影响，不是决定雌性榧树居群遗传结构的主要因素，不符合“距离决定隔离”模式[26]。

Shannon信息指数（I）是一个常用的描述多样性的参数，一般大于0.5时表明多样性丰富。在本研究中，雌性榧树物种水平的I值接近0.5，说明种内多样性丰富，这与该物种雌雄异株异交的特性有关。丰富的多样性一方面使得该物种对环境变化的适应能力增强，另一方面，丰富的变异确实使该物种在物种内具有选择种实性状接近或优于香榧种质的潜力[27]。浙江省已先后从天然榧树群体中选育了12个新品种，并通过了省级认定。此外，太湖源居群因本身群体不大，因此取样数较少，但不影响研究的进行。在银杏Ginkgo biloba[28]、紫苜蓿Medicago sativa[29]、云南沙棘Hippophae rhamnoidessubsp. yunnanensis[30]等物种的群体遗传研究中有类似的报道，但其4个基因遗传参数（Na、Ne、H、I）与另3个居群相比较均偏低，是否与雄株有关还有待于结合雄性榧树群体的遗传多样性开展进一步的研究，因为在大力发展香榧产业之前，许多地方的老百姓不了解榧树的生物学特性，因雄性榧树不结果而砍伐雄性榧树用作薪碳材，以致于出现每年春天香榧授粉期榧树花粉短缺的情况。

榧树的种子目前主要用于香榧砧木苗的繁殖，但实际上其种子的营养成分变异十分丰富[31]，具有开发功能食品的潜力。随着对榧树经济价值认识的日益增加，对其的利用程度也会有所增加，目前浙江省正在进行向榧树分布8省推广香榧种植的工作。在这种情况下，各地更要注重天然榧树资源及其多样性的就地保护，并利用优良雌雄株资源开展常规育种工作，丰富榧树栽培的品种。

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