油桐种子脂肪酸代谢途径基因调控分析

周乃富 ，谭晓风 ，黄丽媛 ，龙洪旭

（中南林业科技大学a.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室；b.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004）

油桐Vernicia fordii是我国特有的经济树种，它与油茶、核桃、乌桕并称为我国四大木本油料植物[1-2]。油桐种子含油率达50%～70%，其中约有94%为不饱和脂肪酸。桐油是良好的干性油，具有干燥快、光泽度高、附着力强、绝缘性能好、耐酸耐碱、防腐防锈等优良性能，在工业上用途广泛[3-6]。桐油为甘油三酯的混合物，从中可探测到的脂肪酸就有9种，主要的有6种，即棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸和酮油酸，其中以桐油酸的含量为最高，约为80%[7]。

从油桐果中提取的桐油，传统上主要用作工业原料。随着环境问题的日益突出，能源危机的不断加剧，油桐作为生物柴油的生产原料，已被列为具有广阔开发前景的能源植物[8]。随着国民经济的发展，桐油的需求量不断增加，但是，国内的油桐资源少，桐油市场供不应求，而且桐油的用途范围在不断扩大[4]。因此，提高桐油产量、改善桐油油脂品质是油桐育种的主要目标。然而，采用常规育种手段，难以满足现代育种的要求，而通过分子育种调控油桐脂肪酸生物合成的途径，促进脂肪酸合成关键基因的超量表达，可以提高油脂的品质，改良脂肪酸组分，也可以调控某一关键基因的表达，以满足合成化工、医药等特殊脂肪酸的需求。为此，本文通过对油桐转录组基因的比对研究，运用分子生物学相关理论分析了油桐脂肪酸代谢途径，探讨了脂肪酸代谢过程中关键酶基因的具体作用，以期对油桐的种子发育和油脂合成分子生物学的研究提供理论依据，为进一步拓展和深化油桐油脂合成和调控的分子机理研究提供必要的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料采集

实验选取的油桐品种为葡萄桐，采样地点位于湘西国家油桐种质资源保存库，分别于6、8、10月采集处于不同发育阶段的油桐种子为实验材料，提取三个时期采集的油桐种子的总RNA，然后对种子的转录组进行RNA测序。

1.2 油桐种仁总RNA的提取和RNA浓度与质量的检测

以Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取油桐种仁中的总RNA。所提取的总RNA是否能达到RNA-Seq实验用的标准（OD260/280为1.8～2.2，28 S ∶ 18 S ＞ 1.0，其浓度≥ 400 ng/μL，其总量≥20 μg，RIN值≥6.5），还需通过Agilent 2100 Bioanalyzer的检测。

1.3 油桐种子转录组数据库的构建

由深圳华大基因研究院完成种子的转录组RNA测序工作，通过序列的组装、Unigene的功能注释（分别将unigene注释到NR、NT、SwissProt、KEGG、COG、GO库中，并分别对注释到每个库及所有注释上的unigene数目进行统计）、Unigene的GO分类（得到相应的GO分类图和GO注释文件）、Unigene代谢通路分析、编码蛋白框的预测（获得CDS核酸序列和CDS蛋白序列）、Unigene表达差异分析，来构建完整的转录组数据库。

1.4 油桐种子转录组数据库的数据分析

对采集于油桐果实发育期的6、8、10月（以下分别简称为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）这三个时期的油桐种子中的总RNA进行了测序，共得到了58 439条非冗余的Unigen序列，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期采集的种子中分别得到了61 001、54 679、44 495条Unigene序列，共涉及128个pathway。还对三个时期采集的油桐种子的基因表达量进行了两两比较，结果如图1所示。由图1可知，大多数Unigene的表达量呈上调趋势，说明基因表达差异显著。

图1 油桐种子在三个不同发育时期差异表达的基因数Fig. 1 Number of differential expression genes in V. fordii seeds at three different development periods

2 结果与分析

2.1 油桐种子脂肪酸代谢途径涉及的功能基因

油桐果实发育期的6、8、10月分别代表了油桐种子油脂合成初期、油脂转化高峰期、油脂积累后期。转录组数据中有37个Unigene序列涉及脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism)途径，占所有非冗余Unigene序列数的0.06%，采用NCBI的BLAST软件对这37个Unigene序列进行了比对，结果发现了10个与脂肪酸代谢途径相关的主要酶功能基因（详见表1），其序列与蓖麻Ricinus communis的相关基因序列比对的相似性很高，均在79%以上，最高达到96%。

2.2 不同时期油桐种子脂肪酸代谢关键酶功能基因的表达及其功能特征

油桐种子脂肪酸代谢关键酶功能基因在种子发育不同阶段的表达差异显著，在种子发育的三个时期的两两对比（Ⅱ期与Ⅰ期、Ⅲ期与Ⅰ期、Ⅲ期与Ⅱ期）中连接AMP依赖酶(AMP dependent ligase)基因表达均为上调，醌氧化还原酶（quinone oxidoreductase）基因表达均为下调。醌氧化还原酶能减少醌类转化可能引起的细胞器及遗传物质的损伤，能保证机体的正常生理功能，因而受到广泛的关注。已有研究结果[9-14]表明，该基因及其产物与多种疾病的发生密切相关。

2.2.1 油桐脂肪转化高峰期和油脂合成初期相关功能基因的表达差异分析

油桐种子脂肪酸代谢关键基因在Ⅱ期和Ⅰ期表达差异的分析结果见表2。由表2 可知，长链脂肪酸辅酶A连接酶、酰基辅酶A氧化酶、酰基辅酶A合成酶、3-羟酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶、3-酮酰辅酶A硫解酶B、酰基辅酶A脱氢酶共7个关键酶基因表达上调，醛脱氢酶和醌氧化还原基因表达下调，其中连接 AMP 依赖酶在Ⅰ期没有表达。在Ⅱ期大量表达的关键酶基因有长链脂肪酸辅酶A连接酶和3-酮酰辅酶A硫解酶B。其中的乙醇脱氢酶（ADH）在乙醇代谢过程中起着重要作用——主要能将乙醇转变为乙醛，在柿饼脱色和果实的贮藏方面具有重要意义[15]。

表1 油桐种子转录组中调控脂肪酸代谢的酶功能基因Table 1 Enzyme functional genes of regulating fatty acid metabolism in V. fordii seed transcriptome

表2 油桐种子脂肪酸代谢关键基因在Ⅱ期和Ⅰ期表达差异的分析结果Table 2 Analysis result of differential expression of the key enzyme genes in V. fordii seed fatty acid metabolism at Ⅰ and Ⅱ periods

2.2.2 油桐脂肪积累后期和油脂合成初期相关功能基因的表达差异分析

油桐种子脂肪酸代谢关键基因在Ⅲ期和Ⅰ期表达差异的分析结果见表3。由表3 可知，酰基辅酶A合成酶、3-羟酰辅酶A脱氢酶、醛脱氢酶、乙醇脱氢酶、3-酮酰辅酶A硫解酶B、酰基辅酶A脱氢酶和醌氧化还原酶共7个关键酶基因表达下调，长链脂肪酸辅酶A连接酶、酰基辅酶A氧化酶和连接 AMP 依赖酶基因表达上调；在Ⅲ期中，除长链脂肪酸辅酶A连接酶的表达量较大外，其余酶基因的表达量均较小。长链酰基辅酶A合成酶（LACS）在脂肪酸代谢中发挥着重要作用，能将游离脂肪酸活化成酰基辅酶A硫脂，该硫脂能参与信号化、转录调节跨膜转运等代谢途径，并且是β氧化的底物[16-17]。酰基辅酶A（ACX）是β氧化的限速酶，参与催化脂肪酸β氧化第一步反应[18-20]。

2.2.3 油桐脂肪积累后期和油脂转化高峰期相关功能基因的表达差异分析

油桐种子脂肪酸代谢关键基因在Ⅲ期和Ⅱ期表达差异的分析结果见表4。由表4 可知，只有连接 AMP 依赖酶基因表达上调，其余关键酶基因表达均下调，在Ⅲ期中，3-酮酰辅酶A硫解酶B基因的表达量最大。

2.3 油桐种子脂肪酸代谢的调控过程

脂肪酸代谢，首先是将脂肪酸进行活化，在脂酰辅酶A合成酶的催化下生成脂酰辅酶A，活化后生成的脂酰辅酶A其极性增强，易溶于水；分子中有高能键，其性质活泼，是酶的特异底物，与酶的亲和力大，更易参加反应。棕榈酸在长链酰基辅酶A合成酶（long-chain acyl-CoA synthetase）的催化下转化成十六酰辅酶A，由于其极性增强，在酰基辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase）和脂肪酰辅酶A脱氢酶（acyl-CoA dehydrogenase）的共同作用下，形成反式-十六酰-2-烯酰辅酶A，在烯酰辅酶A水合酶（enoyl-CoA hydratase）的进一步催化下转化为（s）-3-羟基-十六酰-辅酶A，再由两种脱氢酶——3-羟酰基-辅酶A脱氢酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase）和长链羟酰基辅酶A脱氢酶（long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase）催化，生成3-氧代异戊烯酰辅酶A，最终在乙酰辅酶A乙酰基转移酶 （acetyl-CoA acyltransferase）的作用下转化为辅酶A和十四烷酰辅酶A。由十六酰辅酶A转化成十四烷酰辅酶A，是一个β-氧化的反应过程，脂酰CoA在线粒体基质中进入β氧化要经过四步反应（即脱氢、加水、再脱氢和硫解），生成一分子辅酶A和一个少两个碳的新的脂酰辅酶A。脂肪酸代谢就是经过多次的β-氧化的反应过程来缩短脂肪酸碳链，最终生成乙酰辅酶A。通过β-氧化可将长链脂肪酸改造成长度适宜的脂肪酸，供代谢所需。

表3 油桐种子脂肪酸代谢关键基因在Ⅲ期和Ⅰ期表达差异的分析结果Table 3 Analysis result of differential expression of the key enzyme genes in V. fordii seed fatty acid metabolism at Ⅲ and Ⅰ periods

表4 油桐种子脂肪酸代谢关键基因Ⅲ期和Ⅱ期表达差异分析Table 4 Analysis result of differential expression of the key enzyme genes in V. fordii seed fatty acid metabolism at Ⅲ and Ⅱ periods

3 讨 论

图2 脂肪酸生物代谢途径示意图Fig. 2Diagram of fattyacidmetabolismpathway

桐油是中国的特产，具有很高的经济价值，在中国已有1 300多年的使用历史。与对油桐种植加工的研究一样，对桐油的研究也引起了人们的关注，并取得了一定的成果[21]。傅伟昌等人[22]采用2-氨基-2-甲基丙醇 (2-amino-2-methylpropano,l AMP)衍生化、 GC/M S法分析出桐油的脂肪酸组成，即硬脂酸（3.71%）、软脂酸（3.41%）、油酸（7.07%）、亚油酸（7.51%）、亚麻酸（1.31%）、十八碳共轭三烯酸（73.19%）及未确定的成分（3.80%）。植物油中含有10%～20%的饱和脂肪酸，其主要成分是棕榈酸（C16∶0）。棕榈酰-ACP在脂肪酸代谢过程很关键, 其碳链既能在乙酰-ACP硫脂酶作用下脱 ACP 形成棕榈酸并转化为贮存态油，也可以被 3-酮酯酰ACP合成酶Ⅱ进一步延长，因此植物油中饱和脂肪酸的含量主要是由3-酮酯酰ACP合成酶Ⅱ和硫酯酶活性决定的[23]。

本研究采用RNA-Seq转录组研究技术对油桐种子发育不同时期的转录组进行了比较研究，将油桐种子发育过程中差异表达的基因进行了GO和Pathway信号途径分类，初步明确了参与脂肪酸代谢的蛋白质的功能，为进一步研究基因表达变化和油脂代谢之间的关系奠定了基础。尽管植物脂代谢途径相当复杂,随着近年来分子生物学和基因工程技术的发展，大多数反应步骤已研究得相当透彻[24]，分离了许多关键酶的基因, 使得利用遗传工程手段调控脂肪酸代谢途径、改变脂肪酸成分成为可能[25]。研究油桐种子中油脂积累和转化的分子机理有助于对油桐进行定向的遗传改良，同时这对其他油料作物的基础研究也有一定的参考价值。

到目前为止，油桐的分子生物学研究基础薄弱，能供参考的研究内容很少。本研究从整个转录组的层面分析了油桐种子发育过程中脂肪酸代谢相关酶类的表达模式，为油桐油脂合成机理的研究提供了参考，但对油桐种子中油脂代谢机理的阐明还需大量的验证和深入的研究。

[1] 胡芳名,谭晓风,刘惠民,等.经济林栽培与育种[M].北京:中国林业出版社,2006.

[2] 何 方,胡芳名.经济林栽培学[M].北京:中国林业出版社,2004.

[3] 李军诚.桐油的化学性质及其应用[J].四川轻化工学院学报,1990,(2):31－32.

[4] 谭晓风,蒋桂雄,谭方友,等.我国油桐产业化发展战略调查研究报告[J].经济林研究,2011,29(3):1－7.

[5] 朱镜如,黄 艳,罗克明.重庆油桐资源调查及优株筛选[J].经济林研究,2013,31(1):161－166.

[6] 谭晓风.油桐的发展现状及其发展建议[J].经济林研究,2006,24(3): 62－64.

[7] 方嘉兴,何 方.中国油桐[M].北京:中国林业出版社,1998: 130－134,332－324.

[8] 张玲玲,彭俊华.油桐资源价值及其开发利用前景[J].经济林研究,2011,29(2):130－136.

[9] 万华瑛,陈 彪,杨静芳,等.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸:醌氧化还原酶1基因多态性与认知功能减退和老年性痴呆的关系[J].中国医学科学院学报,2005,27(3):285－288.

[10] 严方方,谭晓风,龙洪旭.油桐β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ基因克隆及序列分析[J].江西农业大学学报,2013,35(4):775－781.

[11] 孙 颖,刘 儒,罗 敏,等.油桐Tunglfy基因在花芽分化期对不同外源激素的分子响应[J].中南林业科技大学学报,2014, 34(4):25－29.

[12] 徐永杰,邓先珍,代新平,等. 基于主成分分析和聚类分析的油桐优良家系抗性综合评价[J].中南林业科技大学学报,2012, 32(7):24－27.

[13] 邵 明,刘焯霖,陶恩祥,等.帕金森病遗传易患性与依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶基因多态性的关系[J].中国临床康复,2005,9(13):182－183.

[14] 任建军,欧阳晓晖,苏秀兰.胃癌发病风险与醌氧化还原酶基因多态性的关系[J].流行病学,2006,13(22):1686－1688.

[15] 张晓霞,毛跟年,张云丽.乙醇脱氢酶应用研究现状[J].动物医学进展,2007,(12):92－95.

[16] SHRAGO E. Long-chain acy-lCoA as amult- ieffector ligand in cellularmetabolism [J].JNutr, 2000, 130(2): 290－293.

[17] WATK I NS P A. Fatty acid activation [J]. Progress in Lipid Research,1997,36(1):55－83.

[18] Arent S, Pye V E, Henriksen A. S tructure and function of plant acyl-CoA oxidases[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2008,46: 292－301.

[19] Lazarow P B, Duve C A. Fatty acyl-coa oxidizing system in rat liver peroxisomes enhancement by clofibrate ahypolipidemic drug[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1976,73:2043－2046.

[20] Kawamoto S, Nozaki C, Tanaka A,et al.Fatty acid β-oxidation system in microbodies of n-alkane-grownCandida tropicalis[J].European Journal of Biochemistry,1978,83:609－613.

[21] 刘玄启.中国桐油史研究[J].广西林业,2007,(1):37－39.

[22] 傅伟昌,顾小红,陶冠军,等.桐油脂肪酸组成分析和甘三酯结构判定[J].天然产物研究与开发,2008,(6):964－968,982.

[23] 王幼平,曾 宇,罗 鹏.植物脂肪酸代谢工程研究进展[J].中国油料作物学报,1998,(4):89－93.

[24] Ohlrogge J B. Design of new plant products engineering of fatty acid metabolism[J]. Plant physiol,1994,104: 821－826.

[25] 周奕华,陈正华.植物种子中脂肪酸代谢途径的遗传调控与基因工程[J].植物学通报,1998,15(5):16－23.