锥栗SRAP反应体系的建立与优化

向 晖 ，袁德义 ，b，贾宝光

（中南林业科技大学a. 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；b.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

锥栗Castanea henryi（Skan） Rehd. et Wils.为我国特有种[1]，属壳斗科栗属植物，俗称榛子，主要分布在我国长江以南的福建、浙江、湖南等近14个省区内。锥栗营养丰富，具有健脾胃、补肾强体等功用[2]，其主干通直，材质坚实，耐水湿，被广泛应用于建筑、造船、家具制造等行业[3]，具有很好的经济价值和利用前景[4]。目前，关于锥栗的研究多限于资源调查、新品种培育、果实性状分析等方面，可对锥栗分子生物学方面的研究报道却较少[3]，而利用SRAP分子标记技术对锥栗进行的研究还未见诸报道。

SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）技术是美国加州大学蔬菜作物系的 Li 与 Quiros[5]于 2001 年在芸薹属植物中开发出来的，是一种基于PCR 的新型分子标记技术。它主要通过独特的引物设计对开放阅读框（ORFs）进行扩增[6]，通过上下游引物的结合，可同时对外显子、内含子和启动子区域进行扩增，且能扩增出特异性[7]。因为不同个体或物种的内含子、启动子和间隔序列不同，故其扩增的多态性高[8-9]；同时，SRAP所需 DNA 的量少而纯度低，操作简单且重复性好[10]。因此，本研究采用单因素试验与正交试验相结合的研究方法，对锥栗的SRAP反应体系进行了优化试验，以期为进一步研究锥栗种质资源的遗传多样性及分子辅助育种奠定基础，也为其他物种的相关研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试样品采自不同野生锥栗单株刚萌发的嫩叶，硅胶保存带回实验室，再置于－80 ℃的低温冰箱中保存以备用。样品信息见表1。

1.2 主要试剂及仪器

PCR扩增所需的Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、10XPCR Buffer（含Mg2+15 mmol/L）均购自TaKaRa生物工程有限公司；DNA marker（DL5000） 购自Solarbio科技有限公司；电泳所用Tris、 琼脂糖等主要试剂均为国产分析纯。SRAP引物由华大基因公司合成，所用引物序列有Me2、Me3、Me5、Em1、Em2、Em4，引物信息详见表2。

表1 样品信息Table 1 Sample information

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.3 试验方法

1.3.1 锥栗总DNA的提取与检测

样品总DNA的提取采用改良的CTAB法[11-12]，试剂盒由天根生化科技有限公司提供，按盒内说明书步骤提取DNA。产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度，最后将DNA浓度稀释至10 ng/μL，于－20 ℃的冰箱中保存。

1.3.2 SRAP基础体系及扩增程序

参照Li等人[5]开发设计的 SRAP 扩增体系及程序，随机选择样品1号与引物Me2- Em1组合进行扩增。

基础体系为：总体系 20 μL，包括 10 ng/μL 模板 DNA 4 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，10×Taq Buffer 2 μL，10 μmol/L 的上游引物、下游引物各 1 μL， ddH2O 10.2 μL。

扩增程序为： 94 ℃预变性 5 min；94 ℃、1 min，35 ℃ 、1 min，72 ℃、1 min，共5个循环；94 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共 35 个循环；72 ℃再延伸10 min，于4 ℃下保存。

1.3.3 SRAP体系单因素优化试验设计

参照基础体系，设8个试验水平（即8个浓度梯度），就不同浓度的模板DNA、Taq 酶、Mg2+、引物、dNTP对SRAP-PCR反应结果的影响情况进行了单因素试验，以优化基础反应体系，从而找出各因素的最佳反应参数。其总体系为20 µL，各影响因子的浓度梯度如表3所示。

表3 SRAP体系优化单因素试验设计Table 3 Design of single factor test for SRAP-PCR system optimization

1.3.4 SRAP体系正交优化试验设计

参照单因素优化试验得到的最优反应参数，对模板DNA浓度、Taq 酶浓度、Mg2+浓度、dNTP 浓度、引物浓度这5 个因素进行了4 个水平的L16（45）正交优化试验，试验设3次重复，正交试验设计分别见表4与表5。再将正交试验结果与单因素试验结果进行对比分析，最终选出了适合锥栗的SRAP最优反应体系。

表4 SRAP反应体系的试验因素与水平Table 4 Factors and levels of SRAP-PCR reaction system

表5 SRAP体系优化正交试验设计L16(45)Table 5 Orthogonal design L16(45) of SRAP-PCR system optimization

1.3.5 产物检测

将PCR 扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，电压110 V，电泳 30～40 min，Gelstain 核酸凝胶染料染色， 置于凝胶成像系统上观察拍照。

1.4 锥栗SRAP最优反应体系稳定性的检测

随机抽取5个模板（2～6号）和2个引物组合（即Me3-Em2与Me5-Em4），对最终确定的锥栗SRAP最优反应体系的稳定性进行了检测。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 模板DNA浓度对SRAP-PCR反应结果的影响

DNA作为PCR反应的模板，是体外扩增反应的基础。模板浓度过低或过高都会影响扩增试验的结果：浓度过低，扩增产物不稳定或无扩增产物；浓度过高可能增加非特异性产物[13]。模板DNA浓度对SRAP-PCR反应结果的影响情况如图1 所示。由图1可知，模板浓度的变化对锥栗SRAP反应的影响不大。20 μL体系中，DNA含量在5～100 ng之间，均可扩增出条带，但在10 ng以下和85 ng以上时，扩增出的条带模糊，条带数少； 处于25～70 ng之间的条带稳定，条带数多且清晰可辨。结合稳定度与样品用量等方面考虑，初步选择模板DNA含量的最适浓度为40 ng。

图1 模板DNA浓度对SRAP-PCR反应结果的影响Fig. 1 Effect of template DNA concentration on SRAP-PCR

2.1.2 Taq DNA聚合酶浓度对SRAP-PCR反应结果的影响

Taq DNA聚合酶浓度对PCR扩增有着显著的影响。浓度过低影响新链合成效率，甚至无法扩增；浓度过高则易造成浪费，产生非特异性条带。本试验设置了1.0～4.5 U 8个梯度以观测TaqDNA聚合酶浓度对锥栗SRAP-PCR反应结果的影响情况，试验结果如图2 所示。从图2中可以看出，Taq酶含量在2.5 U以下时，扩增效果较好；其含量超过2.5 U时，扩增出的条带既模糊又不稳定。综合考虑试验结果和经济因素，初步选定的20 μL体系中Taq DNA聚合酶的最适浓度为2.0 U。

图2 Taq DNA聚合酶浓度对SRAP-PCR反应结果的影响Fig. 2 Effect of Taq DNA polymerase concentration on SRAP-PCR

2.1.3 Mg2+浓度对SRAP-PCR反应结果的影响

作为Taq酶的辅助因子，Mg2+浓度不仅影响Taq酶活性，还能与反应液中的dNTP、模板DNA及引物结合，影响引物与模板的结合效率和模板与PCR产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成[14]。Mg2+浓度对SRAP-PCR反应结果的影响情况如图3 所示。图3显示，当Mg2+浓度为1.4～2.8 mmol/L时，Mg2+浓度对锥栗SRAP反应结果的影响不明显；当其浓度＞2.4 mmol/L时，扩增出的条带数减少；当其浓度超出2.8 mmol/L时，几乎无法扩增出条带；而当其浓度为1.8 mmol/L时，扩增效果最好。

2.1.4 dNTP浓度对SRAP-PCR反应结果的影响

图3 Mg2+浓度对SRAP-PCR反应结果的影响Fig. 3 Effect of Mg2+ concentration on SRAP-PCR

dNTPs与DNA一样，是PCR扩增的基础，作为原料参与新链DNA的合成，对PCR反应有着十分显著的影响。dNTPs浓度过高会使碱基错配率和实验成本增加；而其浓度过低则影响合成效率，产量下降，甚至导致产物单链化。因此，适宜的dNTP浓度对PCR反应至关重要。dNTP浓度对SRAP-PCR反应结果的影响情况如图4 所示。由图4可知，当dNTP浓度低于0.16 mmol/L时，扩增出的条带亮度明显下降；当其浓度低于0.1 mmol/L时，扩增出的条带数量减少且模糊不清；而其浓度为0.16～0.28 mmol/L时，扩增效果区别不大，条带明亮清晰。本试验初步选定的最适于锥栗SRAP反应的dNTP浓度为0.25 mmol/L。

2.1.5 引物浓度对SRAP-PCR反应结果的影响

图4 dNTP浓度对SRAP-PCR反应结果的影响Fig. 4 Effect of dNTP concentration on SRAP-PCR

引物与DNA模板特异性结合，引导新链的合成，在PCR扩增中，起着十分重要的作用。引物浓度关系到扩增产物的质量，浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，增加引物二聚体的形成几率；浓度太低则无法进行有效扩增[15]。试验设置8个引物梯度，结果如图5所示。在引物浓度为0.3～1.0 µmol/L区间内，均能扩增出条带，且其多态性好，但浓度低于0.5 µmol/L和大于0.9 µmol/L时，条带黯淡不清晰。因此，在保证条带稳定且清晰的前提下，最适于锥栗SRAP反应的引物浓度可为0.6 µmol/L。

2.2 正交试验结果的直观分析

L16（45）正交试验的电泳结果如图6所示。按照遗传多样性分析要求，参考何正文等人[16]的方法，对PCR扩增结果从高到低依次打分。总分16分，条带数量丰富、清晰度高，背景低的最佳产物记为16分，与此相反，最差的则记为1分。3次重复试验独立评分，结果见表5。根据得分平均值求出每个因素同一水平下的试验值之和Ki（即ΣKi，i＝1,2,3,4）以及每一因素水平下的数据平均值Ki（即Ki＝Ki/4），并求出同一因素不同水平间平均值的极差R值（即R＝Kmax－Kmin，Kmax为单个试验因素中Ki的最大值；Kmin为单个试验因素中Ki的最小值），结果见表6。

图5 引物浓度对SRAP-PCR反应结果的影响Fig. 5 Effect of primer concentration on SRAP-PCR

图6 正交试验扩增结果Fig. 6 Amplification results of orthogonal test

表 6 正交结果的直观分析Table 6 Intuitive analysis of orthogonal result

结合图6与表5分析，处理组合1、2、7、14的得分很低，条带效果不理想。其中处理组合1、2的条带量少且黯淡，扩增产物少，其原因是模板、Taq酶浓度、dNTP浓度比较低，新链合成效率不高；处理组合7的条带量较少，其原因是Mg2+浓度过高，影响了Taq DNA聚合酶的活性，同时dNTP浓度低，影响了产物的合成；处理组合14条带少，这可能因为模板和引物浓度过高，而Taq酶浓度和dNTP浓度又过低。参考表5的评分，综合3次重复试验结果，考虑稳定性、条带数、条带亮度及清晰度，初步选择处理组合15为最适反应体系。

对正交试验结果进行直观分析得出，影响锥栗SRAP反应结果的5个重要因素为模板DNA浓度、Taq 酶浓度、Mg2+浓度、dNTP 浓度、引物浓度，这5个因素对PCR反应结果的影响效力存在明显差异。极差R值反映了每个因素对SRAP反应的影响程度，R值越大，表示该因素对试验结果影响越显著[15]。表6说明，RdNTP浓度＞RTaq酶浓度＞R引物浓度＞RMg2+浓度＞R模板浓度，即影响因子dNTP浓度对锥栗SRAP反应结果的影响最大，其次为Taq酶浓度，对其影响最小的是模板DNA浓度。Ki值反映了各因素不同水平对反应体系的影响情况，Ki值越大，表示对应的梯度水平越好，对反应体系的影响效果越佳。各试验因素不同试验水平对锥栗SRAP反应结果的影响情况如图7 所示。由图7可知，模板DNA浓度的最佳水平为40 ng，Taq酶浓度的最佳水平为2.0 U，Mg2+浓度的最佳水平为1.8 mmol/L，dNTP浓度的最佳水平为0.28 mmol/L，引物浓度的最佳水平为0.8 µmol/L。但由此得出的5因素的最佳水平组合，在正交设计表中并没有出现。另一方面，正交设计中得分最高的处理组合15，与此最佳组合十分接近，两者只有模板DNA浓度与引物浓度不一致，而极差R值说明，这两个因素对锥栗SRAP反应结果的影响并不大，因此，综合比较分析之前的单因素试验结果，最终确定的锥栗SRAP-PCR反应最佳体系为：20 μL体系中，模板DNA浓度40 ng，Taq酶浓度2.0 U，Mg2+浓度1.8 mmol/L，dNTP浓度0.28 mmol/L，引物浓度 0.6 µmol/L。

图7 各试验因素不同试验水平对锥栗SRAP反应结果的影响Fig. 7 Effects of different test levels of each test factor on SRAP-PCR in C. henryi

2.3 最优体系稳定性检测

随机抽取5个模板与2个引物组合对最终确定的锥栗SRAP最优反应体系的稳定性进行检测，结果如图8所示。图8中，编号为1～5的试验所用引物组合为Me3- Em2，所用模板依次为模板2、模板3、模板4、模板5、模板6；编号为6～10的试验所用引物组合为Me5- Em4，所用模板依次为模板2、模板3、模板4、模板5、模板6。扩增产物条带丰富、清晰可辨，稳定重复性好，表明最终优化后的该体系适用于锥栗SRAP分子标记试验。

3 讨 论

图8 锥栗SRAP最优反应体系稳定性检测结果Fig. 8 Test result of stability of the optimal SRAP-PCR system in C. henryi

SRAP是一种基于PCR的新型分子标记技术，由美国加州大学蔬菜系的两位博士Li和Quiros于2001年在发表的Springer-Verlag杂志中提出[5]，其操作简单，重复性好，具有高频率的共显性，且不需要预知物种的序列信息，扩增条带多态性和信息量丰富，易于分离测序[10]。与其他分子标记技术相比，RAPD存在重复性和稳定性较差，SSR检测的位点较少、引物开发费时且成本高，AFLP分析程序复杂、成本昂贵等问题。而SRAP弥补了上述各项标记的不足，并以其独有的优点已成为一种比较理想的分子标记技术[17]。目前，SRAP技术已成功运用于甜菜[18]、色蕉[19]、牡丹[20-21]、野牛草[22]、甜瓜[10]、水稻、马铃薯、莴苣、白菜、大豆、油菜、大蒜、苹果、生菜、柑橘、樱桃、芹菜等植物的研究中[23-24]，但还没有人将此标记方法应用于锥栗研究中。因此，建立一套锥栗SRAP-PCR反应最优体系，可为锥栗的后续分子生物学研究奠定基础。

虽然SRAP技术已广泛应用于其他植物的研究中，但同样的方法在不同植物中的应用会有差异，如郑婷婷[25]、郭大龙[26]、史红丽[27]、徐颖[28]等人的研究结果均不同。由此可见，对锥栗进行SRAP反应体系的优化试验是十分必要的。

当前，常见的分子标记体系的优化方法主要有两种：一种是单因素试验法；一种是正交试验法。两种方法各有利弊。单因素试验设计简单，操作误差小[29]，可快速而又直观地表现出各因子对反应体系的影响情况，但不能体现出各因素之间的互作效应[13]。正交试验可以很好地反映出各影响因素之间的互作效应，具有布点均衡、试验次数少、结果直观等优点[30]，但对其结果的评价往往带有主观性，试验结果直接受评分高低的影响，缺乏一定的可靠度。因此，本试验采用单因素试验与正交试验相结合的方法进行综合分析，可扬长避短，能更有效、更准确地得出锥栗SRAP最优反应体系，保证体系的稳定性。

本研究分析得出，PCR的影响因素之间并不是独立而是相互起作用的，但各因素的影响力度不一样。DNA与dNTP一样，是PCR扩增的基础。dNTP浓度过高会增加碱基的错配率；其浓度过低则影响合成效率，甚至导致产物单链化。但是，试验结果表明，锥栗SRAP反应对DNA的要求不高，而对dNTP浓度的要求严格。另一方面，Mg2+作为Taq酶活性的影响因子，不仅干扰Taq酶参与反应的效率，还能与其他影响因子结合，从而影响反应进程。而文中的试验结果表明，Mg2+浓度在1.4～2.8 mmol/L 的范围内时，其对反应的影响不大，因此，此浓度范围是适合锥栗SRAP标记的。比较两种分析方法，单因素试验中，Taq酶浓度和dNTP浓度对PCR扩增的影响较大，而模板DNA浓度的影响较小；正交试验中，根据极差R值同样可以得出，影响较大的因素仍是dNTP浓度和Taq酶浓度，其次是引物浓度，模板浓度的影响最小，这与单因素试验结果高度一致。相比其他植物而言[31-33]，采用两种方法研究的结果高度一致的情况并不多见，这在一定程度上也凸显了锥栗的特殊性，以及不同物种试验前体系优化的必要性。在具体的试验因素与水平上，单因素试验分析所得的模板浓度、引物浓度、dNTP浓度和正交试验分析所得的结果并不完全一致，这可能与PCR反应本身的不稳定性和主观评分有关，由于两种方法的结果在总体趋势上保持高度一致，因而具体试验因素与水平的差异并不影响最终结果的准确性与可靠度，最终优化体系的验证试验也证实了此结论。最后，本研究得出的最优体系组合，即 20 μL体系中，模板DNA浓度40 ng，Taq酶浓度 2.0 U，Mg2+浓度 1.8 mmol/L，dNTP浓度0.28 mmol/L，引物浓度0.6 µmol/L，可为锥栗进一步的遗传多样性分析、遗传图谱的构建、亲缘关系及种质资源的鉴定与研究奠定了基础，也为其他物种的分子标记研究提供了理论参考。

[1] 郎 萍,黄宏文.栗属中国特有种居群的遗传多样性及地域差异[J].植物学报,1999,41(6):651－657.

[2] 孔沈鲁,陈锦权.锥栗贮藏温度对淀粉降解速率的影响[J].农业工程学报,2004,20(5):222－224.

[3] 刘国彬,龚榜初,罗正荣.锥栗自然居群 ISSR-PCR 分析技术的建立[J].果树学报,2009,26(1):103－107.

[4] 潘超然,鲍世利,陈锦权.锥栗贮藏过程维生素C的降解速率以及保鲜条件研究[J].农业工程学报,2003,19(6):234－237.

[5] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism(SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction:Its application to mapping and gene tagging inBrassica[J].Theoretical and Applied Genetics,2001,103:455－461.

[6] 彭邵峰,张党权,陈永忠,等.14个油茶良种遗传多样性的SRAP分析[J].中南林业科技大学学报,2011,31(1):80－85.

[7] M A Espo´sito, E A Martin, V P Cravero,et al.Characterization of pea accessions by SRAP’s markers[J].Scientia Horticu Lturae,2007,113:329－333.

[8] 祝全东,张党权,李晓云,等.油茶SRAP标记的PCR体系建立与优化[J].中南林业科技大学学报,2010,30(3):57－62.

[9] 韩 欣,张党权,王志平,等.基于SRAP的赣南油茶良种分子鉴别研究[J].中南林业科技大学学报,2012,32(3):147－151.

[10] Ferriol M, Pico B, Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection ofCucurbita pepousing SRAP and AFLP markers[J].Theor Appl Genet, 2003,107(2): 271－282.

[11] 黄少勇,张智俊,罗淑萍,等.山核桃EST-SSR引物的筛选及通用性分析[J].经济林研究,2013,31(3):10－15.

[12] 张建英,毛向红,张莹莹.利用RAMP分子标记对酸枣资源的遗传多样性分析[J].经济林研究,2014,32(2):14－18.

[13] 郭凌飞,邹明宏,曾 辉,等.澳洲坚果ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].林业科学,2008,44(5):160－164.

[14] 曾艳玲,谢 鹏,谢耀坚,等.桉树ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J].中南林业科技大学学报,2008,28(1):44－48.

[15] 穆立蔷,刘赢男,冯富娟,等.紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].林业科学,2006,42(6):26－31.

[16] 何正文,刘运生,陈立华.正交设计直观分析法优化PCR条件[J].湖南医科大学学报,1998,23(4):403－404.

[17] 陈 罡,吴立国.SRAP 标记及其在林木遗传育种研究中的应用前景[J].辽宁林业科技,2009,(6):48－51.

[18] Nevena N L, John W, Robert L. Detection of DNA polymorphism in sugarbeet bulks by SRAP and RAPD markers[J]. Journal of Biotechnology, 2007, (Supplement): 131－132.

[19] Youssef M, James A C, Rivera M R,et al. Musa genetic diversity revealed by SRAP and AFLP[J]. Molecular Biotechnology, 2011,47(3): 189－199.

[20] Han Xiao-yan, Wang Liang-sheng, Liu Zheng-an,et al.Characterization of sequence-related amplified polymorphism markers analysis of tree peony bud sports[J]. Scientia Horticulturae, 2008, 115:261－267.

[21] Han Xiao-yan, Wang Liang-sheng, Shu Qing-yan,et al.Molecular characterization of tree peony germplasm using Sequence-Related Amplified Polymorphism markers[J].Biochemical Genetics, 2008, 46:162－179.

[22] Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I,et al. Molecular characterization of buffalo grass germplasm using sequencerelated amplified polymorphism markers[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 108:328－334.

[23] Xiaoming Wu, Xiaohua Qi, Mingfang Zhang,et al. Molecular phylogeny of Chinese vegetable mustard (Brassica juncea) based on the internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA[J]. Genet Resour Crop Evol, 2007, 54: 1709－1716.

[24] 李 严, 张春庆. 西瓜杂交种遗传多态性的 SRAP 标记分析[J]. 园艺学报, 2005, 32(4):643－647.

[25] 郑婷婷,林 萍,王开良,等.油茶SRAP-PCR反应体系的优化[J].林业科学研究,2010,23(2):302－307.

[26] 郭大龙,罗正荣.部分柿属植物 SRAP- PCR 反应体系的优化[J].果树学报,2006,23(1):138－141.

[27] 史红丽,韩明玉,赵彩平.桃SRAP-PCR反应体系的建立与优化[J].华北农学报,2008,23(增刊):201－204.

[28] 徐 颖,韩 影,赵巍巍,等.山梨 SRAP 反应体系的建立[J].湖北农业科学,2010,49(1):24－26.

[29] 邱 帅,丁信誉,席梦利,等.东方百合 SRAP 体系优化及引物筛选[J].南京林业大学学报,2013,37(3):6－10.

[30] 姜荣波,姜景民,刘 军,等.红楠ISSR-PCR反应体系的建立和优化[J].林业科学研究,2011,24(2):194－199.

[31] 方 攀,张运城,袁虎威,等.樟子松SSR反应体系优化[J].基因组学与应用生物学,2013,32(3):413－419.

[32] 李 鹏,汪阳东,陈益存,等.油桐ISSR-PCR最佳反应体系的建立[J].林业科学研究,2008,21(2):194－199.

[33] 陈亮明,相 阳,张冬林,等.两种方法对广玉兰ISSR-PCR反应体系的优化比较[J].种子,2008,27(6):10－14.