肺癌表皮生长因子受体基因测序分析

王剑蓉，陈 劼，孙 怡，李 惠，赖仁胜

（南京中医药大学附属医院病理科国家中管局三级分子生物学实验室，江苏 南京 210029）

·论 著·

肺癌表皮生长因子受体基因测序分析

王剑蓉，陈 劼，孙 怡，李 惠，赖仁胜

（南京中医药大学附属医院病理科国家中管局三级分子生物学实验室，江苏 南京 210029）

目的 探讨中国人肺癌患者表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变状态。方法用基因测序的方法检测了416例肺癌肿瘤细胞标本EGFR基因第18、19、21外显子，并检测了其中11例EGFR第20外显子区域。23例肺癌患者血液标本作为对照。结果416例肿瘤标本中共发现118例(28.37%)EGFR基因突变，其中19外显子缺失突变占46.09%，21外显子点突变占42.19%，并发现了4例EGFR第20外显子区域突变(4/11)。23例肺癌患者血液标本均未发现突变。肺腺癌的突变率为32.52%，比鳞癌(12.96%) (P=0.004)、其他类型癌(13.89%)(P=0.021)增高，差异有统计学意义。EGFR基因突变在女性患者中(36.72%)所占比例比男性患者高(22.18%)(P=0.001)。结论女性、肺腺癌患者EGFR突变率高，提示可能在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的治疗中获益。

EGFR基因；突变；肺癌

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一。化疗在中晚期非小细胞肺癌(NSCLC)治疗中占据主要地位，但疗效不尽如人意。近几年，以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的分子靶向治疗在NSCLC的治疗中日渐突出。根据分子标志选择EGFR-TKIs受益人群，是优化治疗的重要环节。因此采用EGFR基因状态作为预测分子标志物，指导EGFR-TKIs的治疗，是一个重要而又有实际意义的问题。为探讨中国人群EGFR基因突变状态，2008-2012年我们对416例肺癌肿瘤标本及23例血液标本进行EGFR基因测序，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 分组 观察组416例均为肿瘤标本，其中有376例肺癌石蜡标本、34例癌性胸水、2例新鲜组织、4例痰细胞涂片。男性239例，女性177例，年龄29～87岁，平均62.0岁；其中肺腺癌326例、鳞癌54例、其他类型癌(包括腺鳞癌、小细胞癌、大细胞癌等)共36例。所有肿瘤组织均经病理确诊。对照组23例经病理确诊的肺癌患者血液标本，男性14例，女性9例，年龄43～82岁，平均64.5岁。每例抽取静脉血2 ml。

1.2 引物 经NCBI提供的EGFR全基因组序列(NM-005228)和mRNA序列，设计PCR引物，见表1。

表1 EGFR基因外显子18、19、20、21PCR扩增引物序列

1.3 基因测序方法 416例肿瘤标本用Omega公司试剂盒，23例血液标本DNA用Promega公司试剂盒提取DNA。以凝胶电泳系统检测DNA模板的质量，用Eppendorf核酸定量仪测定DNA含量大于20 ng/μl纳入检测。PCR扩增：使用ABI-2700型测序级扩增仪，扩增目的基因片段。PCR产物利用ABI 3100I-Avant测序仪进行检测。发现有缺失或突变的病例，都用反向引物进行反向测序验证。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，采用行X列表χ2检验，结果均以P＜0.05为差异有统计学意义，必要时用Fisher精确概率法。

2 结 果

2.1 EGFR基因突变与肺癌组织学分型 观察组416例肿瘤标本中共发现118例(28.37%)EGFR基因突变，其中肺腺癌的突变率为32.52%，比鳞癌(12.96%)(χ2=8.48，P=0.004)和其他类型癌(13.89%) (χ2=5.29，P=0.021)增高，差异均有统计学意义。但鳞癌与其他类型癌的突变率比较差异无统计学意义(χ2=0.04，P=0.899)，见表2。

表2 观察组EGFR基因突变与肺癌组织学分型（例）

2.2 EGFR基因突变与性别 EGFR基因突变在女性患者所占比例是36.72%，显著高于男性的22.18%，见表3。

表3 观察组EGFR基因突变与性别的关系(例)

2.3 不同标本类型EGFR基因突变率 观察组416例标本中共发现118例(28.72%)EGFR基因突变，肿瘤石蜡组织中EGFR突变率为28.91%(109/377)，高于癌性胸水中的突变率20.59%(7/34)。对照组23例肺癌患者血液标本均未发现突变，见表4。

表4 肺癌患者肿瘤标本EGFR突变率(例)

2.4 EGFR突变位置、频率及类型 416例肺癌肿瘤标本中118例EGFR基因突变，见表5。突变的形式有：(1)外显子19突变：外显子19大部分为缺失突变，占总突变的46.09%，较多为del2235-2249，其次为del2236-2250、del2240-2254、del2240-2257、del2238 -2255、del2240-2252、del2240-2253l、del2240-2248、del2239-2247、del2239-2252、del2239-2253、del2239 -2256、del2239-2258、del2235-2250、del2236-2253、del2236-2257、del2251-2262、del2250-2264、del2241 -2249；外显子19的插入性突变：2235 CTC ins；点突变 ：2237A＞T、2248G＞C和 2253A＞G、2223 C＞T (P741P)、2239-2240 TT＞CC；(2)外显子21点突变：占总突变的42.19%，其中最多见为2573 T＞G(L858R)，占总突变的37.5%、其他类型有：2582 T＞G、2582T＞A为少见的突变类型，2497 T＞G、2504A＞T、2570 G＞A、2603 A＞G、2609 A＞G(H870R)；(3)外显子18点突变：2174C＞T，缺失突变：del2127-2129；(4)外显子20点突变：2361G＞A、2371位C＞T；（5）内含子突变：外显子18前104位内含子A＞C、21外显子后第94位内含子A＞G。416例肺癌肿瘤标本，EGFR基因突变率为28.37%，突变绝大多数位于19、21号外显子，占总突变的88.28%。其中19外显子缺失突变占总突变的46.09%，21外显子点突变占42.19%，见表6。

表5 118例肺癌EGFR突变情况

表6 118例肺癌EGFR基因突变位置分布

3 讨 论

EGFR在多种恶性肿瘤包括NSCLC中高表达，由于EGFR酪氨酸激酶是信号传导的必要条件，因而成为肿瘤治疗的重要靶分子。EGFR酪氨酸激酶是包含有1 186个氨基酸链的跨膜蛋白，由胞外的受体和胞内区组成，在NSCLC的表达高达40%～80%。抗EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼、埃罗替尼)较早用于治疗NSCLC的研究中。

EGFR基因是ErbB家族一员，位于染色体7p12-14区。EGFR基因酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，在肺癌中EGFR基因突变90%以上，集中在18-21外显子，其中特征性突变主要有：(1)19外显子缺失，主要是编码氨基酸（KELREAT）序列缺失，这一缺失改变了EGFR受体ATP结合囊的角度，增强了肿瘤细胞对小分子酪氨酸激酶抑制剂的敏感性[1]。(2)21外显子点突变，第858位密码子亮氨酸置换成精氨酸（L858R），其作用使A-loop的稳定性增强，提高了肿瘤细胞对EGFR-TKIs的敏感性。(3)20外显子的点突变，主要是第790位密码子出现C-T转换（T790M），突变使得肿瘤细胞对吉非替尼或埃罗替尼产生耐药性[2]。(4)18外显子点突变。

对EGFR基因突变的数据分析表明，尽管突变部位分散在整个酪氨酸激酶编码区，但89%的突变集中在19外显子的缺失和第21外显子的L858R点突变[3]。我们检测了416例肺癌肿瘤标本，EGFR基因突变率为28.37%，EGFR的基因突变位于18～21号外显子，主要是19外显子的缺失和21外显子点突变占总突变的88.28%。其中21外显子点突变最常见的类型为L858R。

EGFR-TKI的高敏感性与EGFR的突变明显相关。多项前瞻性随机临床试验，表明吉非替尼和埃罗替尼作为一线治疗EGFR突变的非小细胞肺癌患者与化疗相比，改善预后。NEJ002研究[4]显示，吉非替尼组患者比紫杉醇加卡铂组有一个较长的中位PFS (10.8个月vs 5.4个月；HR 0.30，95%CI 0.22～0.41；P＜0.001)和较高的反应率(73.7%和30.7%；P＜0.001)。埃罗替尼作为一线治疗与标准化疗对比治疗欧洲进展期EGFR突变的非小细胞肺癌患者的一项多中心、开放性、随机的第3期试验[5]显示埃罗替尼组中位PFS为9.7个月，而标准化疗组为5.2个月(HR 0.37，95% CI 0.25～0.54；P＜0.000 1)，且埃罗替尼组较标准化疗组副作用小。

不同的EGFR突变类型预示EGFR-TKIs临床治疗效果的差异。Jackman等[6]对EGFR基因突变NSCLC患者进行的亚组分析结果表明，19外显子缺失患者总生存期及到进展/死亡时间都长于21外显子L858R点突变者，且前者在症状改善方面也优于后者。应用吉非替尼治疗NSCLC患者中19外显子的碱基缺失突变生存期明显长于21外显子的点突变。突变导致EGFR活性增加，下游增殖通路被高度激活，因此称为EGFR的激活性突变。E746-A450缺失和L858R的突变与TKI的疗效高度相关。Charpidou等[7]对568例非小细胞肺癌患者的分析结果：在所有NSCLC患者中大约90%的EGFR基因突变集中于19或21外显子中，其中19外显子的缺失及21外显子中的点突变的患者服用EGFR-TKI的有效率均达到70%以上。

20外显子的突变可能与肿瘤细胞的获得性耐药有关。应用吉非替尼有效的EGFR基因突变患者最终会产生耐药。约有一半获得性耐药的患者被证实在它们的肿瘤细胞中发现了EGFR的二次突变(T790M)。T790M突变大多数导致获得性耐药,但也与原发耐药相关[8]。EGFR外显子20的插入性突变(D770-N771)可以使受体对EGFR-TKI的敏感性降低100倍，临床上也发现具有此突变的患者对EGFR-TKI治疗反应不明显[9]。因此检测EGFR不同的突变类型有助于预测分析EGFR-TKIs治疗NSCLC临床疗效。

EGFR-TKIs治疗NSCLC的疗效与EGFR酪氨酸激酶结构域基因变异、种族、人群等多种因素有关。在非选择性NSCLC标本，EGFR突变率在北美为3%～25%，南欧为10%～24%[10]。美国NSCLC患者中只有约10%的突变，然而在亚洲人中，约30%的NSCLC患者有EGFR的基因突变[8，11]。

多项临床试验表明，亚裔、女性、无吸烟史、腺癌为吉非替尼和埃罗替尼药物治疗的优势人群，通过这种优势人群的选择可使TKIs药物的有效性升高到40%以上[12-14]。我们的研究再次证实了肺癌患者中女性、腺癌的EGFR突变率高，为EGFR-TKIs治疗的优势人群，这与以往的文献报道一致[15]。

我们检测了416例肺癌患者肿瘤标本，发现不同组织的EGFR突变率有所不同，肿瘤石蜡切片中EGFR突变率为28.91%(109/377)，高于癌性胸水中的突变率20.59%(7/34)。这可能与肿瘤组织数量及肿瘤细胞与非肿瘤细胞百分比有关。癌性胸水中肿瘤细胞的数量以及与正常细胞百分比可能小于石蜡组织中，因此可能导致突变比例偏低。我们检测了23例肺癌患者血液标本，未能发现EGFR基因突变，这可能与直接测序法的敏感性有关。直接测序法可以发现新的突变位点，通过正反双向测序进行比较，是检测基因突变的金标准，但如果突变细胞比例小于百分之十，直接测序法不易测出。

肺癌肿瘤组织的EGFR基因检测，为靶向药物吉非替尼或埃罗替尼疗效提供有效的分子水平的预测指标，为NSCLC治疗及耐药评估提供依据，可以广泛应用于临床。

[1]Shigematsu H,Lin L,Takahashi T,et al.Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers[J].J Natl Cancer Inst,2005,97(5):339-346.

[2]Onitsuka T,Uramoto H,Nose N,et al.Acquired resistance to gefitinib:The contribution of mechanisms other than the T790M,MET, and HGF status[J].Lung Cancer,2010,68(2):198-203

[3]Chan SK,Gullick WJ,Hill ME.Mutations of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer search and destroy[J]. Eur J Cancer,2006,42(1):17-23.

[4]Maemondo M,Inoue A,Kobayashi K,et al.Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR[J].N Engl J Med,2010,362:2380-2388.

[5]Rosell R,Carcereny E,Gervais R,et al.Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC):a multicentre,open-label,randomised phase 3 trial[J]. Oncology,2012,13:239-246.

[6]Jackman DM,Miller VA,Cioffredi LA,et al.Impact of epidermal growth factor receptor and KRAS mutations on clinical outcomes in previously untreated non-small cell lung cancer patients:results of an online tumor registry of clinical trials[J].Clin Cancer Res,2009, 15(16):5267-5273.

[7]Charpidou A,Blatza D,Anagnostou V,et al.Review.EGFR mutations in non-small cell lung cancer—clinical implications[J].In Vivo,2008,22(4):529-536

[8]Sequist LV,Bell DW,Lynch TJ,et al.Molecular predictors of response to epidermalgrowth factor receptorantagonists in non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2007,25(5):587-595.

[9]Kobayashi S,Boggon TJ,Dayaram T,et a1.EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J].N Ensl J Med,2005,352:786.

[10]Pinter F,Papay J,Almasi A,et al.Epidermal growth factor receptor (EGFR)high gene copy number and activating mutations in lung adenocarcinomas are not consistently accompanied by positivity for EGFR protein by standard immunohistochemistry[J].J Mol Diagn, 2008,10(2):160-168.

[11]Mitsudomi T,Kosaka T,Yatabe Y.Biological and clinical implications of EGFR mutations in lung cancer[J].Int J Clin Oncol, 2006,11:190-198.

[12]Pao W,Miller V,Zakowski M,et al.EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from“never smokers”and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(36):13306-13311.

[13]Marchetti A,Martella C,Felicioni L,et al.EGFR mutations in non-small cell lung cancer:analysis of a large series of cases and development of a rapid and sensitive method for diagnostic screening with potential implications on pharmacologic treatment[J].J Clin Oncol,2005,23(4):857-865.

[14]Shigematsu H,Lin L,Takahashi T,et al.Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers[J].J Natl Cancer Inst,2005,97(5):339-346.

[15]Kim KS,Jeong JY,Kim YC,et al.Predictors of the response to gefitinib in refractory non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res, 2005,11(6):2244-2251.

Epidermal growth factor receptor sequencing analysis in lung cancer.

WANG Jian-rong,CHEN Jie,SUN Yi,Li Hui,LAI Ren-sheng.Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,The Third Grade Laboratory of Molecular Biology of State Administration of TCM,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA

Objective To study the mutation patterns of epidermal growth factor receptor gene in Chinese lung cancers.MethodsEGFR exons 18,19,21 were performed in 416 tumor specimens of lung cancer by direct DNA sequencing,and exon 20 was detected in 11 patients among them.Blood samples of 23 patients were performed as controls.ResultsEGFR mutations were identified in 118 of the 416(28.37%)cases,including in-frame deletion in exon 19(46.09%)and point mutation in exon 21(42.19%),and 4 cases of exon 20 mutations were found in 11 patients.No mutation was found in the blood.The mutation rate of lung adenocarcinoma was 32.52%,which was higher than that in squamous cell carcinoma(12.96%)(P=0.004)and other types of lung cancers(13.89%)(P=0.021).The mutations occurred more frequently in females(36.72%)than in males(22.18%)(P=0.001).The mutation rate of EGFR in formalin-fixed,paraffin embedded tissue was 28.91%(109/377),which was higher than in malignant pleural effusion 20.59%(7/34).ConclusionOur data indicated that Chinese female lung adenocarcinoma patients could benefit from EGFR tyrosine kinase inhibitors.

Epidermal growth factor receptor gene;Mutation;Lung cancer

R734.2

A

1003—6350（2014）10—1405—04

2013-11-07)

江苏高校优势学科建设工程资助项目(编号：012062003010)

王剑蓉。E-mail：jrwang00@126.com