臭氧、臭氧水对感染性创面修复作用的分子生物学研究

李云恺，陈丽艳，王 惠，邱思强

(1.济南第四人民医院外五科，山东 济南 250031；2.济南第四人民医院护理部，山东 济南 250031；3.济南市中医医院，山东 济南 250012)

臭氧、臭氧水对感染性创面修复作用的分子生物学研究

李云恺1，陈丽艳2，王 惠3，邱思强1

(1.济南第四人民医院外五科，山东 济南 250031；2.济南第四人民医院护理部，山东 济南 250031；3.济南市中医医院，山东 济南 250012)

目的 运用分子生物学的方法探讨臭氧水和臭氧对创面愈合的疗效。方法40只Vista大鼠感染性创面造模成功后按换药方式的不同随机分为四组：洗必泰治疗组、臭氧组、臭氧水组、对照组，每组各10只；换药9 d后评价四组大鼠创面的愈合情况并运用ELISA方法测量感染前、感染后2 d以及治疗后第3、6、9天大鼠皮肤肌肉标本中FGFs的含量。结果χ2检验显示四组的有效率差异有统计学意义(t=50.48，P＜0.05)，臭氧水组的有效率最高(70%)，臭氧组其次(50%)，但优于洗必泰组(30%)和对照组(10%)。除感染前外，各个干预组的FGFs含量均与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)；同时治疗后第3、6天臭氧水组的FGFs含量[(124.05±7.94)μg/kg，(179.02±14.95)μg/kg]明显高于臭氧组[(78.98±7.22)μg/kg，(112.97±12.66)μg/kg]和洗必泰组[(54.86±6.38)μg/kg，(56.03±7.8)μg/kg]，差异具有统计学意义(t=2.737、2.893、3.022，2.907，均P＜0.05)，在治疗后第9天，臭氧组的FGFs含量[(263.79±40.09)μg/kg]与臭氧水组[(260.12±28.9)μg/kg]比较差异无统计学意义(t=-1.023，P＞0.05)。结论臭氧和臭氧水均是高效消毒剂，均能够通过提高皮肤肌肉组织中FGFs的含量促使创面的愈合，但臭氧水要优于臭氧。

臭氧；臭氧水；FGFs；创面愈合

随着生活科技技术的现代化进程，高能量创伤的发病率逐年上升，由此导致的感染性创面的发生率也逐年增加，据统计约有25%的伤员需要较长时间的伤口和创面处理[1]。最近几年，感染性创面的臭氧治疗越来越受到各国医学工作者的青睐，原因在于其简单、安全、创伤小、费用低[2]。以往的研究主要集中在臭氧气体的作用，很少见臭氧水处理感染性创面的相关报道。但是有研究发现臭氧溶于水后同样具有强大的氧化作用[3]，因此2012-2013年笔者设计本研究选择成纤维细胞生长因子(FGFs)作为观察指标，从分子生物学角度探讨臭氧水对感染性创面的修复作用，报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物 Vista大鼠40只(雌雄鼠分别20只)，体质量(200±15)g，大鼠符合Ⅰ级清洁动物的等级标准。

1.2 实验设备 臭氧发生器、日本OLYMPUS CHB-213照相显微镜、光学显微镜。

1.3 实验制剂及材料 双蒸水、金黄色葡萄球菌(菌液浓度＞20亿/ml)、新型止血海绵(由湛江卫生材料厂提供)、EGF试剂盒(96/48人份酶标板、塑料膜板盖、生物素标记的抗EGF抗体、亲和链酶素一HRP)、磁力搅拌棒、加样器。

1.4 实验方法

1.4.1 臭氧水制备 将二次蒸馏水倒入臭氧消毒剂生成机(采用武汉市康桥电子消毒设备厂研制的“260型臭氧消毒治疗机”)的储水槽中(容量约2 500 ml)，室温20℃，制取10 mg/L、20 mg/L的臭氧水，用于创面的清洗和消毒[2]。

1.4.2 动物分组 40只Vista大鼠按换药方式的不同随机分为四组：洗必泰治疗组、臭氧组、臭氧水组、对照组，每组各10只，称重标记(饲养环境温度保持在26℃，室内湿度70%，保持室内良好通风状态)。

1.4.3 建造实验模型 将Vista大鼠适应性喂养1周，实验前1 d将各组大鼠脊背和左侧大腿处脱毛备皮，乙醚麻醉，获得大鼠4～5 cm背部裸露皮肤的模型，消毒后沿脊柱右侧全层切开皮肤可以深达筋膜的线型切口长约3 cm，开放创口，常规止血后，在伤口处均匀涂抹菌液浓度＞20亿/ml的金黄色葡萄球菌，使实验大鼠形成感染创面。所有大鼠均按上述方法造模，手术时间大约持续5 h[3]。

1.4.4 给药方法及标本采集 各组模型感染成功后按照预先分组制定的实验要求第2天开始用药，每天一次，9 d为一个疗程，在治疗前、治疗后3 d、6 d、9 d分别对感染伤口的变化进行观察，评价创面愈合情况，抽取静脉血检查白细胞计数，切取皮肤、肌肉组织标本进行光镜病例分析。各组均于感染前、感染后2 d、治疗后第3、6、9天分别取切口皮肤、肌肉组织标本(零下70℃保存)，用Elisa法测量FGFs的含量。

1.4.5 观察指标 (1)创面愈合情况。评价标准[4]分为四级：①非常明显：切口完全愈合或切口稍有红肿但无渗出，不影响愈合；②较明显：切口基本愈合，局部(＜1 cm)愈合欠佳但无渗出；③不明显：切口部分愈合(＜1 cm)，未愈合部分有红肿渗出；④无：感染切口较治疗前无变化甚至恶化。有效率(%)=非常明显+较明显/总例数×100%。(2)检测大鼠肌肉皮肤中FGFS含量。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0软件进行统计学处理，创面愈合情况以百分率表示，组间比较采用χ2检验，FGFs含量以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 感染创面愈合情况 感染2 d后，所有实验观察大鼠创面均出现了炎症反应，表面有炎性渗出物。实施了不同的干预措施后，χ2检验显示四组的有效率差异有统计学意义(χ2=50.48，P＜0.05)，臭氧水组的有效率最好(70%)，臭氧组其次(50%)，但优于洗必泰组(30%)和对照组(10%)。

表1 各组大鼠的创面愈合情况[只（%）]

2.2 FGFS含量变化 通过单因素方差分析，除感染前外，各个干预组的FGFs含量均与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)；同时治疗后第3、6天臭氧水组的FGFs含量明显高于臭氧组和洗必泰组，差异具有统计学意义(t=2.737、2.893、3.022，2.907，均P＜0.05)，在治疗后第9天，臭氧组的FGFs含量与臭氧水组比较差异无统计学意义(t=-1.023，P＞0.05)，见表2。

表2 大鼠FGFs在不同观察期的含量变化(±s)

表2 大鼠FGFs在不同观察期的含量变化(±s)

组别FGFs(µg/kg)臭氧水组(n=10)臭氧组(n=10)洗必泰组(n=10)对照组(n=10) F值P值感染前43.04±4.78 43.91±4.12 45.01±3.97 45.01±2.49 1.682＞0.05感染后2 d 73.06±10.65 57.08±5.68 49.07±3.41 50.03±3.48 24.993＜0.05治疗后3 d 124.05±7.94 78.98±7.22 54.86±6.38 49.08±1.97 35.01＜0.05治疗后6 d 179.02±14.95 112.97±12.66 56.03±7.8 44.98±2.43 55.44＜0.05治疗后9 d 263.79±40.09 260.12±28.9 56.99±6.99 42.96±3.35 49.98＜0.05

3 讨 论

医用臭氧(Medical ozone，02-03)是利用医用纯氧制备的臭氧与纯氧的混合气体，具有较强的氧化作用，能通过氧化还原作用迅速杀灭细菌，为广谱有效的强杀菌剂[5]。随着对医用臭氧的生物药学特性认识的深入研究，臭氧在医疗界中被广泛应用，在欧洲等地医用臭氧广泛用于治疗糖尿病足、创伤及皮肤溃疡的愈合、脑中风、溃疡性结肠炎、关节炎、椎间盘突出症等疾病，其临床疗效得到了充分肯定[6]。

通过氧化作用破坏微生物细胞膜从而实现杀菌是臭氧杀菌的重要机理。研究发现湿度和温度的提高有利于加强臭氧的消毒作用，当臭氧溶解到水中会有更强劲的杀菌消毒和分解催化作用，能把有机物、重金属分解或转化为对人体无害的物质[7]。臭氧水杀菌的广谱性使之能够在短时间内有效杀灭金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、流感病毒等多种微生物，具备高效的杀菌速率[8]。同时，臭氧水杀菌产生的活性氧可以维持人体正常呼吸，促进创面的愈合[9]。利用该类物质杀菌可以很好的避免使用抗生素带来的不良反应，具有无痛苦、起效快的优点。臭氧具有强氧化性与不稳定性，在常温常压空气中易还原为氧气(半衰期45 min)。臭氧可溶于水，在常温常压下臭氧在水中的溶解度比氧高约13倍，比空气高25倍。但臭氧在水中的分解速度比空气中快的多。如水中臭氧浓度为6.25×105mol/L(3 mg/L)时，其半衰期为5～30 min，但在纯水中分解速度较慢，如在蒸馏水或自来水中的半衰期大约是20 min(20℃)，然而在二次蒸馏水中，经过85 min后臭氧分解只有10%，若水温接近0℃时，臭氧会变得更加稳定。因此本研究采用二次蒸馏水制备臭氧水[10]。

成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors，FGFs)是一种多肽，能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用[11]。部分国内外研究显示，FGFs参与调控创伤修复的全过程，巨噬细胞、血小板以及内皮细胞是其主要来源，而淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞也可以生成FGFs[12]。Plichta等[13]报道免疫细胞之间相互调控促使创面的愈合，该类调控十分精确，是通过FGFs等活性生物分子的释放实现的。Narita等[14]研究发现创面形成后数小时后会出现炎症反应，为抵御细菌的负面作用，巨噬细胞会攻击微生物并分泌多种细胞生长因子如FGFs等。目前，关于在创面愈合的过程中出现FGFs的大量分泌和积累，促使创面愈合的理论已获得共识，本研究正是利用这一理论通过观测FGFs在不同干预组的变化情况来分析臭氧水和臭氧以及洗必泰治疗的不同功效。研究结果显示，在治疗大鼠感染性创面方面臭氧水和臭氧的有效率明显优于洗必泰治疗和对照组，同时臭氧水的方法又优于臭氧组，治疗后第3、6天臭氧水组实验大鼠皮肤和肌肉中FGFs含量明显高于其他三组，但治疗后第9天臭氧水组合臭氧组FGFs含量差异无统计学意义；说明臭氧和臭氧水增加了创面FGFs的含量，从而促进细胞分裂增殖，以达到伤口愈合的目的，并且臭氧水的效果要优于臭氧。

综上所述，臭氧水可促进感染性创面的修复，其效果优于臭氧和洗必泰，值得临床推广应用。

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Molecular biology study on the effects of ozone and ozone water in repairing the infective wounds.

LI Yun-kai1,CHEN Li-yan2,WANG Hui3,QIU Si-qiang1.1.The Fifth Surgical Department,The Fourth People's Hospital of Jinan, Jinan 250031,Shandong,CHINA;2.Nursing Department,Fourth People's Hospital of Jinan,Jinan 250031,Shandong, CHINA;3.The Hospital of Traditional Chinese Medicine of Jinan,Jinan 250012,Shandong,CHINA

Objective To explore the effects of ozone and ozone water in repairing the infective wounds by using molecular biology methods.Methods40 vista rats with infective wounds were randomly divided into 4 groups according to different ways of changing the dressing:chlorhexidine treatment group(n=10),ozone group(n=10),ozone water group(n=10)and the control group(n=10).The reparations of the infective wounds of rats in each group were observed and evaluated 9 days after the dressings changing and the FGFs from skin and muscle specimens of all rats in different groups were detected before the treatment,48h after infection and the 3rd,6th and 9th day of treatment by ELISA.Resultsχ2test showed the difference of effective rate between each group was significantly important(χ2=50.48，P＜0.05).The effective rate of ozone water group was the highest(70%)and that of ozone group was the second(50%) higher than that of chlorhexidine group(30%)and control group(10%).The values of FGFs in treatment groups were significantly higher than that of control group except for the values before the infection.Meanwhile,the values of FGFs on the 3rd and the 6th day of treatment in ozone water group(124.05±7.94)μg/kg,(179.02±14.95)μg/kg were higher than that of ozone group(78.98±7.22)μg/kg,(112.97±12.66)μg/kg and that of chlorhexidine group(54.86±6.38)μg/kg, (56.03±7.8)μg/kg,and the differences were statistically significant(t=2.737、2.893、3.022,2.907,P＜0.05).On the 9thday after treatment,the difference of FGFs value between ozone water group[(263.79±40.09)μg/kg]and ozone group [(260.12±28.9)μg/kg]was not significantly important(t=-1.023,P＞0.05).ConclusionOzone and Ozone water were both effective disinfectant,they could contribute to the wound healing by improving the FGFS level in skin and muscle tissue.However,the recovery effect of ozone water was better than that of ozone.

Ozone;Ozone water;FGFs;Wound healing

R-332

A

1003—6350(2014)10—1409—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.10.0545

2013-11-22)

济南市科技发展计划项目（编号：201121063）

李云恺。E-mail：byzhanshi@126.com