“温阳补气”针法对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠血清IL-12和IL-18表达水平的影响及其作用机制①

王洪峰 李 实 董 理 王宇峰(长春中医药大学，长春 130117)

重症肌无力(Myasthenia gravis，MG)是一种以部分或全身骨骼肌无力和极易疲劳为主要临床表现的自身免疫性疾病，大量的研究［1-3］证明:IL-12和IL-18在MG的发病过程中具有重要的作用，并与MG的病情严重程度密切相关。中医学认为MG属于“痿证”的范畴，患者以脾气虚弱、肾阳不足为主要病机，笔者以温阳补气为主要治疗原则，采用针灸疗法治疗本病取得了良好的临床疗效。为进一步研究“温阳补气”针法治疗MG的作用机制，本研究采用国际公认的免疫接种法建立实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠动物模型，观察该针法对EAMG大鼠血清中IL-12和IL-18表达水平的影响，以期为针灸治疗MG提供客观的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Lewis大鼠80只，雌性，6～8周龄，平均体质量(162.21±4.7)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号码:SCXK(沪)2007-0005，检疫后送至长春中医药大学实验动物中心，标准大鼠颗粒饲料喂养。

1.2 主要试剂和仪器 AchRα1 129～145多肽片段(美国Sigma公司);大鼠AchR-ab ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司);大鼠IL-12 ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司);大鼠IL-18 ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司);溴吡斯的明(60 mg/片，上海三维制药有限公司);Σ960型全自动酶标仪(美国Metertech公司);T-500型电子天平(美国双杰兄弟集团有限公司);GS-15R低温高速离心机(美国Beckman公司);微量加样器(日本Nichiryo公司);0.25 mm×25 mm毫针(苏州医疗用品厂有限公司);艾绒(南阳绿莹艾草生物制品有限公司)。

1.3 大鼠EAMG模型建立方法 选取SPF级Lewis大鼠60只，采用免疫接种法建立EAMG大鼠动物模型。将AchRα1 129～145多肽片段按照1∶2的比例与弗氏完全佐剂(CFA)完全乳化，配比按照200 μl溶液内含有50 μg片段，不足部分用 pH7.4的PBS液定容至20 ml，充分混匀制成免疫乳剂，取一滴乳剂滴入水中呈现球形而不分散为乳化好的标志。首次免疫接种时，将上述抗原乳剂以300 μl/只(含 AchRα1 129～145:75 μg)多点注射于大鼠四只足垫部、尾根部、背部。在首次免疫后第4和第8周，分别进行强化免疫接种，将AchRα1 129～145多肽片段以1∶2的比例与弗氏不完全佐剂(IFA)完全乳化，配比按照200 μl溶液含有50 μg片段，不足部分用pH7.4的PBS液定容至20 ml，以200 μl/只(含 AchRα1 129～145:50 μg)多点注射于大鼠四只足垫部、尾根部、背部。以 Lennon分级评分≥1分［4］，同时AchR-ab呈阳性为EAMG大鼠模型造模成功标准。

1.4 分组及治疗方法 选取建模成功的EAMG大鼠30只，随机分为针灸治疗组、药物对照组和模型对照组，每组10只，选取同期购进未建模的SPF级Lewis大鼠10只设为空白对照组。针灸治疗组予以“温阳补气”针法治疗，手三里(双)直刺5 mm，足三里(双)直刺6 mm，脾俞(双)直刺6 mm，肾俞(双)直刺6 mm，平补平泻，针上加灸，30 min/次，1次/d，7 d为1疗程，疗程间休息1 d，连续治疗2个疗程。药物对照组予以溴吡斯的明灌胃治疗，18.5 mg/(kg·d)，连续治疗15 d。模型对照组和空白对照组大鼠不予特殊处置，同等条件下饲养，每日抓取1次，观察一般情况。

1.5 检测指标及方法 大鼠血清IL-12、IL-18表达水平的检测:治疗后抽取大鼠尾根静脉血，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清中IL-12和IL-18的表达水平，具体方法按上海研辉生物科技有限公司说明书操作。

1.6 数据处理方法 在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。计量资料均用表示，采用Newman-Keuls法进行单因素多样本均数比较，采用Spearman等级相关进行相关回归分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠血清IL-12表达水平 模型对照组EAMG大鼠血清中IL-12表达水平显著升高，与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01);针灸治疗组和药物对照组EAMG大鼠血清中IL-12的表达水平均明显下降，与模型对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);但针灸治疗组与药物对照组比较，两组EAMG大鼠血清中IL-12的表达水平无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠血清IL-18表达水平 模型对照组EAMG大鼠血清中IL-18表达水平显著升高，与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01);针灸治疗组和药物对照组EAMG大鼠血清中IL-12的表达水平均明显下降，与模型对照组比较，差异均具有显著的统计学意义(P＜0.01);但针灸治疗组与药物对照组比较，两组EAMG大鼠血清中IL-18的表达水平无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠血清IL-12的表达水平(n=10，，pg/ml)Tab.1 Serum IL-12 expression levels of rats in various groups(n=10，，pg/ml)

表1 各组大鼠血清IL-12的表达水平(n=10，，pg/ml)Tab.1 Serum IL-12 expression levels of rats in various groups(n=10，，pg/ml)

q Groups IL-12 Acupuncture treatment 0.093 8 Model 32.71 ± 9.37(P＜0.01)(P＜0.05)(P＜0.05)(P＞0.05)Acupuncture treatment 23.94±3.88 vs Drug control Blank control 14.26±3.53 9.110 6 4.332 1 4.2383 Blank control vs Model Acupuncture treatment vs Model Drug control vs ModelDrug control 24.13±6.97

表2 各组大鼠血清IL-18的表达水平(n=10，，pg/ml)Tab.2 Serum IL-18 expression levels of rats in various groups(n=10，，pg/ml)

表2 各组大鼠血清IL-18的表达水平(n=10，，pg/ml)Tab.2 Serum IL-18 expression levels of rats in various groups(n=10，，pg/ml)

q Groups IL-18 Acupuncture treatment 7 6 0.218 9 Model 115.55 ± 20.60(P＜0.01)(P＜0.01)(P＜0.01)(P＞0.05)Acupuncture treatment 96.15±12.63 vs Drug control Blank control 27.49±5.81 20.962 0 4.618 7 4.83 Blank control vs Model Acupuncture treatment vs Model Drug control vs Model Drug control 95.23±9.40

图1 Lennon症状评分与IL-12表达水平的线性回归曲线Fig.1 Lennon symptom score and level of expression of IL-12 linear regression curve

2.3 Lennon症状评分与EAMG大鼠血清IL-12表达水平的相关性分析 以EAMG大鼠的Lennon症状评分为因变量，以EAMG大鼠血清IL-12的表达水平为自变量，进行多元线性回归分析显示，IL-12的表达水平与Lennon症状评分呈线性正相关，等级相关系数r=0.970 2，P＜0.01，说明 IL-12的表达水平与EAMG大鼠的临床症状严重程度具有紧密的相关性。见图1。

2.4 Lennon症状评分与EAMG大鼠血清IL-18表达水平的相关性分析 以EAMG大鼠的Lennon症状评分为因变量，以EAMG大鼠血清IL-18的表达水平为自变量，进行多元线性回归分析显示，IL-18的表达水平与Lennon症状评分呈线性正相关，等级相关系数r=0.930 9，P＜0.01，说明 IL-18的表达水平同样与EAMG大鼠的临床症状严重程度具有紧密的相关性。见图2。

图2 Lennon症状评分与IL-18表达水平的线性回归曲线Fig.2 Lennon symptom score and level of expression of IL-12 linear regression curve

3 讨论

乙酰胆碱受体抗体(Acetylcholine receptor antibody，AchR-ab)与神经肌肉接头处(Neuromus-cular junction，NMJ)突触后膜的乙酰胆碱受体(Acetylcholine receptor，AchR)特异性结合，加速AchR的降解，导致突触后膜上AchR数量减少，阻碍了神经电信号的传导是MG产生的主要原因。干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是Th1 类细胞因子，在MG 患者和 EAMG 大 鼠 中 均 有 高 水 平 的 表 达［5，6］，并 与AchR-ab之间在表达水平上呈正相关系，IFN-γ可能作为效应因子参与了MG的发病过程。大量的研究［7-9］表明:IL-12具有促进IFN-γ的分泌、调节 Th1细胞的应答、与IL-18的协同诱导IFN-γ分泌等生物学效应。Sitaraman等［10］通过实验发现:给予EAMG小鼠不同剂量的IL-12，其临床症状会随着给予剂量的增加而加重。Moiola等［11］在研究中还发现:IFN-γ基因被敲除的小鼠在被给予IL-12后并没有EAMG症状。IL-18是具有多种生物学效应的前炎性细胞因子，可以高水平地诱导IFN-γ的产生，还可以同时调节Th1和Th2类应答的细胞因子，在EAMG的发病过程中具有高水平的表达［12］。本研究也证明，IL-12、IL-18在EAMG大鼠的血清中均具有较高水平的表达，并且IL-12和IL-18均与Lennon症状评分呈线性正相关的关系，说明IL-12和IL-18在EAMG的发病过程中具有重要的作用，并与EAMG病情的严重程度紧密相关。尽管IL-12和IL-18在EAMG的发病过程中具有重要、特殊和复杂的作用，但其主要作用机制与强力诱导IFN-γ的生成和表达有关。此外，MG主要是由于Th1和Th2类免疫应答异常而导致的一种自身免疫性疾病，IL-12、IL-18还可能通过调节Th1和Th2类的免疫应答参与了MG的发病过程。

国内中医学者［13-15］认为MG患者以虚证居多，其病因多由起居失常、劳逸失衡、饮食不节和七情内伤所致，其病位主要在脾肾二脏，其病机主要为脾胃虚弱致气血化生乏源，或肾阳不足至精血亏虚，以致筋肉失于濡养，久之导致机体颓痿无力。“温阳补气”针法根据MG患者脾气虚弱，肾阳不足的主要病机，取手阳明经穴之手三里，取足阳明经穴之足三里，坚持了“治痿独取阳明”的治疗原则;同时，脾为“后天之本”、“气血生化之源”，肾为“先天之本”，藏命门之火，取脾俞、肾俞两穴，通过温补“先天之本”，健运“后天之本”，以调节脾肾二脏之虚弱不足，达到了温阳补髓、益气养血、濡润宗筋、补气助力、壮肌治痿的治疗目的。通过本研究可发现:“温阳补气”针法可以直接降低EAMG大鼠血清中IL-12和IL-18的表达水平，继而抑制IFN-γ的生成表达，已达到治疗EAMG大鼠重症肌无力的作用;“温阳补气”针法对EAMG大鼠具有良好的治疗作用，其治疗效果与溴吡斯的明相近，推测该针法对人体MG症状同样会具有较好的治疗作用，但人体MG的病因及症状明显比EAMG大鼠复杂，其具体治疗作用有待通过系统的临床研究进行证实。

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