大籽蒿花粉过敏原的分离、鉴定与纯化①

李兴永 肖小军 孙宏治 何韶衡 杨平常 刘志刚

(辽宁医学院附属第一医院，锦州 121000)

据世界卫生组织(WHO)报道变态反应性疾病(过敏性疾病)是当前世界性的重大卫生学问题，此类疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等，是临床常见病、多发病［1，2］。花粉是一种重要的致敏原，且在世界范围内花粉过敏性疾病的发病率不断增加［3］。近年的花粉调查显示，蒿属花粉仍为中国北方地区夏秋季最重要的致敏花粉［4-6］，由于蒿属花粉种类繁多且具有地区差异性，因此对蒿属花粉过敏原有必要进行深入研究。大籽蒿花粉是我国蒿属花粉中常见且致敏性较强的一种，但有关大籽蒿花粉主要过敏原成分的分析鉴定未见报道。本研究通过SDS-PAGE、Western blot和离子交换层析对大籽蒿花粉过敏原进行分离、鉴定与纯化，为临床过敏性患者的诊断及治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 大籽蒿花粉采自辽宁锦州市郊区，过敏性患者及正常人血清由辽宁医学院附属第一医院检测并采集，在深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所保存备用，过敏性患者血清均为蒿属花粉皮肤点刺试验阳性患者的血清。

1.2 主要仪器与试剂 垂直电泳槽、转膜电泳槽(Model 1 000/500)、凝胶成像及分析系统;亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二铵(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、联苯二胺(DAB)为AMRESCO公司产品;上样缓冲体系、蛋白Marker为MBIFermentas公司产品;硝酸纤维膜(NC膜)、透析带、生物素标记的IgE二抗、链霉亲和素(HRP)购自 Sino-American Biotec;DEAE-Cellulose DE-52为Amersham Pharmacia公司产品。其余均为国产分析纯试剂。

1.3 大籽蒿花粉粗提液的提取 花开季节收集花粉，取10 g大籽蒿花粉，用液氮充分研磨成粉末，加丙酮浸泡脱脂脱色，去丙酮风干后用PBS溶液充分溶解，4℃搅拌过夜，然后12 000 r/min，4℃，离心15 min，取上清，重复2次，将上清液过0.45 μm滤膜，冷冻干燥存储备用。

1.4 大籽蒿花粉粗提液的SDS-PAGE用SDSPAGE体系分离大籽蒿草花粉粗提液蛋白组分，并测定其分子量。分离胶为12%，浓缩胶为5%，考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色后用凝胶成像及分析系统拍照并分析其分子量。

1.5 大籽蒿花粉粗提液的免疫学特性鉴定 取备用的蒿属花粉过敏患者和非蒿属花粉过敏正常人血清各11份，进行Western blot检测。实验步骤:用Bio-Rad转移槽将凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维膜上，TBS洗涤2次，5 min/次，将膜用3%BSA封闭液封闭(4℃冰箱过夜);倒去封闭液，TBST洗膜3 次，5 min/次;加入1%BSA-TBST 5∶1稀释的一抗，37℃孵育2 h，倒去一抗，同上洗膜3次后加入2 000∶1稀释的二抗-生物素，室温孵育2 h，倒去二抗，同上洗膜3次后加入5 000∶1稀释的链酶亲和素-HRP，室温孵育2 h，同上洗膜5次，DAB显色，拍照并分析其Mr。

1.6 大籽蒿花粉粗提液的离子交换层析与检测大籽蒿花粉提取液冷冻干燥后用0.02 mol/L Tris-HCl(pH7.2)缓冲液透析12 h并过0.45 μm滤膜备用。DE-52离子交换层析柱以0.02 mol/L(pH7.2)的Tris-HCl缓冲液充分平衡，待穿透峰后的基线走平后上样，改用洗脱缓冲液(0.5 mol/L NaCl、0.02 mol/L Tris-HCl)进行线性离子梯度洗脱，用EP管收集各峰液，并进行 SDS-PAGE、Western blot，拍照并确定各峰收集液中蛋白的免疫活性。

2 结果

2.1 大籽蒿花粉粗提液的SDS-PAGE结果 大籽蒿花粉粗提液经SDS-PAGE可见20多种蛋白条带(图1)，主要集中在10～16 kD和25～70 kD之间，其中分子量(Mr)为62、57、38、29、25、14 kD 等 6 个条带蛋白含量最丰富。

2.2 大籽蒿花粉粗提液的Western blot结果 11例蒿属花粉过敏患者的血清进行免疫印迹检测，均有阳性反应条带出现，其中Mr 62 kD和16 kD的过敏原与过敏患者血清特异性IgE结合率最高(均大于50%)，为其主要过敏原(图2);而无蒿属花粉过敏的正常人血清呈阴性反应，未见阳性反应条带。

2.3 大籽蒿花粉过敏原的纯化

2.3.1 花粉过敏原的离子交换层析结果 用DE-52离子交换层析缓冲液透析的大籽蒿花粉粗提液上柱。可见大籽蒿花粉提取液主要有5个峰。见图3。

2.3.2 各峰SDS-PAGE和Western blot结果 分析表明，大籽蒿花粉提取液经离子交换层析后，其蛋白主要分布在Ⅰ～Ⅴ峰。见图4。免疫印迹结果显示，Mr 16 kD的主要过敏原组分在Ⅱ峰，而Mr 62 kD的主要过敏原组分在Ⅲ～Ⅴ峰。见图5。

图1 大籽蒿花粉粗提液SDS-PAGE图Fig.1 SDS-PAGE of Artemisia sieversiana pollen extract

图2 大籽蒿花粉粗提液免疫印迹图Fig.2 Western blot of Artemisia sieversiana pollen extract

图3 大籽蒿花粉粗提液离子交换层析图Fig.3 Ion exchange chromatography(IEC)of Artemisia sieversiana pollen

3 讨论

气传致敏花粉是引起呼吸道变态反应性疾病，如过敏性鼻炎、过敏性哮喘等花粉症主要过敏原。来自菊科的蒿草花粉颗粒是全世界的主要过敏原来源之一［7］，而大籽蒿花粉是蒿属花粉过敏的重要致敏性花粉之一，也是我国北方最重要的过敏原之一。自从John Bostoek(1989)首次提出花粉症以来，国内外学者发现花粉中最主要的致敏成分是蛋白质［8］，并通过制备主要致敏花粉过敏原浸液，用于诊断和治疗呼吸道的过敏性疾病，并取得了一定的疗效［9］。由于天然粗提浸液过敏原的成分非常复杂，不仅含有引起花粉症的致敏原蛋白组分，而且还含有多种其他成分，且容易为外源性的毒性物质、病原微生物污染，影响其安全性;同时某些致敏蛋白组分具有蛋白酶活性，可降解其他致敏蛋白组分，影响效价［10］。因此分离纯化花粉主要过敏原，确定其免疫学特性对研究呼吸道过敏性疾病的病因和治疗是极其重要的。

图4 大籽蒿花粉粗提液离子交换层析后Ⅰ～Ⅴ峰液的SDSPAGE结果Fig.4 SDS-PAGE of ion exchange chromatography(IEC)peakⅠ-Ⅴ of Artemisia sieversiana pollen

图5 大籽蒿花粉粗提液离子交换层析后Ⅰ～Ⅴ峰液的免疫印迹结果Fig.5 Western blot of ion exchange chromatography(IEC)peakⅠ-Ⅴ of Artemisia sieversiana pollen

本研究通过SDS-PAGE凝胶电泳可以看到大籽蒿花粉分离后可得到20多种蛋白组分，其中Mr为62、57、38、29、25、14 kD 的 6 个条带蛋白含量最丰富，Mr 62 kD和16 kD的蛋白组分与蒿属花粉过敏患者血清特异性IgE结合率最高(均＞50%)，为主要过敏原。该花粉主要过敏原Mr 62 kD的蛋白条带与杨慧等［8］对艾蒿花粉过敏原进行分离鉴定检出的Mr 62 kD的蛋白条带相同。另外从SDS-PAGE与Western blot两实验结果比较分析，我们发现SDS-PAGE实验中蛋白含量高的条带与蒿属过敏患者血清特异性IgE结合率并不一定高，如Mr 29 kD的蛋白条带未检测到与蒿属花粉过敏原特异性IgE结合，同时也发现不同种类的蒿属花粉也具有其特异性的过敏原成分，如大籽蒿花粉主要过敏原Mr为16 kD与Nilsen等［11］检出的Artemisia vulgaris L花粉主要过敏原Mr为22 kD不同，与杨慧、刘志刚等［12］对青蒿花粉过敏原进行分离鉴定出的主要过敏原Mr 43 kD的蛋白条带亦不同;而且针对不同花粉过敏患者而言，其致敏的过敏原亦不尽相同，本研究结果表明蒿属花粉虽然种类繁多，但各种花粉之间可能存在共同过敏原成分。所以对不同的蒿属花粉过敏原进行分离、鉴定与纯化具有重要的临床意义。因此，本实验为进一步研究变态反应性疾病的特异性过敏原制剂及探讨呼吸道变态反应性疾病更快速、安全、有效的诊断和治疗方法提供理论支持。

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