过表达MIPU1降低阿霉素所致人胚胎肾HEK293细胞的凋亡

时春丽，蒋 磊，肖献忠*

(湖南省妇幼保健院 中南大学 1.检验科； 2.湘雅医学院 病理生理学教研室， 湖南 长沙 410008)

研究论文

过表达MIPU1降低阿霉素所致人胚胎肾HEK293细胞的凋亡

时春丽1，蒋 磊2，肖献忠2*

(湖南省妇幼保健院 中南大学 1.检验科； 2.湘雅医学院 病理生理学教研室， 湖南 长沙 410008)

目的探讨过表达MIPU1对阿霉素(Doxorubicin,DOX)所致细胞凋亡的影响及其可能的分子机制，为预防DOX抗肿瘤治疗过程中的毒副作用提供新的思路。方法1)MTT实验观察DOX处理下过表达MIPU1对细胞存活率的影响；2)Hoechst染色和流式细胞术分析过表达MIPU1对DOX所致细胞凋亡的影响；3)RT-PCR和Western blot分析过表达MIPU1对DOX所致Bcl- 2、P53和Bax在mRNA水平和蛋白水平上表达变化的影响。结果过表达MIPU1后，细胞存活率明显升高(Plt;0.05vspEGFP+DOX)，凋亡率显著下降(Plt;0.01vspEGFP+DOX)，P53和Bax的表达显著下降(Plt;0.05vspEGFP+DOX)，而Bcl- 2的表达则明显增多(Plt;0.05vspEGFP+DOX)。结论过表达MIPU1能降低DOX引起的HEK293细胞凋亡，可能与抑制P53和Bax的表达同时促进Bcl- 2的表达有关。

细胞凋亡；阿霉素； MIPU1；Bax；Bcl- 2

Mipu1(myocardial ischemic preconditioning up-regulated gene 1)是在大鼠心肌缺血预适应中发现的一种表达上调的新基因，其蛋白是一种KRAB型锌指蛋白，具有转录调控的作用。针对大鼠的Mipu1已做了很多的功能研究[1- 3]，并发现过表达Mipu1能分别抑制H2O2和TNF-ɑ诱导的Fas和Bid蛋白的表达，且这种抗凋亡作用与直接和启动子结合而抑制其表达有关[4]。

阿霉素是临床常用的抗肿瘤药物，在发挥其强大抗肿瘤作用[5]的同时出现了很多副作用，其中在阿霉素肾病模型中，肾小球硬化，肾小管萎缩，在硬化区和萎缩区凋亡细胞数明显增多[6]。在阿霉素导致的肾脏损伤中，某些凋亡蛋白发生了明显的变化[7]。Mipu1作为一种新发现的蛋白，其能否在DOX所致的细胞损伤中发挥保护作用则还不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚胎肾细胞HEK293(American type culture collection,ATCC)；DMEM(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物)；阿霉素(Doxorubicin,货号44583，Sigma公司)；pEGFP-MIPU1质粒； Bax抗体(Epitomics公司)；Bcl- 2抗体、P53抗体(安博生物技术有限公司)；Mipu1抗体、MTT检测试剂盒、Hoechst33258(Sigma公司)；GFP抗体(Cell Signaling公司)；流式凋亡检测试剂盒Annexin ⅴAPC/PI(eBioscience公司)。

1.2 引物序列(表1)1.3 HEK293细胞的培养及处理

细胞按照1×106个/每瓶接种50 cm2培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培基培养。细胞置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中，待细胞增殖状态好汇合度达到80%以上时用来做后续实验。根据实验要求进行相应处理。

1.4 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)步骤

实验分为两步进行，具体见说明书。

表1 引物序列Table 1 Primer sequemce

反应条件：GAPDH：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25个循环；MIPU1：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环； Bax：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25个循环； Bcl- 2：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32个循环；P53：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环。琼脂糖凝胶电泳检测所扩条带，凝胶成像系统拍照后Quantity One软件进行灰度扫描分析。

1.5 蛋白质免疫印迹检测目的蛋白

细胞经过处理到达时间点PBS洗1～2遍后裂解细胞，超声15 s，置于冰上继续裂解30 min。4 ℃，12 000 r/min离心20 min。将上清液转移到新的Eppendorf管中即得到细胞的总蛋白。将80 μg蛋白与5×SDS上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸10 min。样品经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，50 mA稳流湿转过夜至PVDF膜上。室温封闭4 h后加入相应一抗，4 ℃反应过夜。TBST洗膜液洗3次，每次10 min，加入相应二抗，室温摇床慢速反应45 min，TBST洗膜液洗3次，每次10 min，DAB显色，吸光度扫描定量分析。

1.6Hoechst33258染核，检测细胞核凋亡形态及凋亡百分率计算

经过实验处理后4%多聚甲醛固定10 min， Hoechst33258 20 μg/mL染色后孵育15～20 min，荧光显微镜下观察细胞核形态。随机选取3个视野，每个视野200个细胞核，计算凋亡百分率，即凋亡百分率=(凋亡细胞核/200)×100%。

1.7 MTT检测细胞存活率

细胞接种于96孔板中，浓度为1×107/L，每孔200 μL，根据实验处理完细胞后每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液， 4 h后吸去培养液，每孔加入150 mL DMSO，置于摇床上低速振荡10 min，使甲瓒结晶物充分溶解，酶标仪490 nm处测量各孔的吸光度值。

1.8 流式细胞数检测细胞凋亡

具体按照eBioscience公司的AnnexinⅤ Staining Protocols试剂盒进行操作。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 过表达MIPU1对细胞存活率的影响

HEK293细胞瞬时转染pEGFP或pEGFP-MIPU1 24 h后1 μmol/L DOX处理24 h，pEGFP+DOX组的细胞存活率比pEGFP组明显下降，当过表达MIPU1后则细胞存活率明显增加(图1)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP;#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX图1 MTT实验检测过表达MIPU1对细胞存活率的影响Fig 1 Effect of MIPU1 overexpression on DOX-inducedHEK293 cells death using MTT assay(±s,n=3)

2.2Hoechst33258染核观察过表达MIPU1后细胞凋亡的变化

转染pEGFP和pEGFP-MIPU1后，胞核呈均匀的蓝色荧光，当DOX处理24 h后，转染pEGFP的胞核发生明显的皱缩，聚集甚至碎裂，细胞发生了凋亡，而转染pEGFP-MIPU1细胞核的凋亡明显减少(图2)。

A.pEGFP; B.MIPU1; C.pEGFP+DOX; D.MIPU1+DOX; *Plt;0.01 compared with pEGFP; #Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX图2 Hoechst33258染核检测过表达MIPU1对DOX所致HEK293细胞凋亡的影响Fig 2 Hoechst 33258 staining showed the percentageof apoptosis cells(×200,n=3)

2.3流式细胞术检测MIPU1过表达对细胞凋亡率的影响

pEGFP+DOX组的细胞凋亡率较pEGFP组显著增多；转染MIPU1后细胞凋亡率明显下降(图3)。

apoptosis: R3+R5; *Plt;0.01 compared with pEGFP; #Plt;0.01 compared with pEGFP+DOX图3 流式细胞术检测过表达MIPU1对DOX所致HEK293细胞凋亡的影响Fig 3 Effects of MIPU1 overexpression on DOX-induced HEK293 cells apoptosis by flowcytometry(n=3)

2.4过表达MIPU1对DOX所致P53的mRNA表达的影响

与pEGFP组相比，pEGFP+DOX组P53的mRNA表达增多；与pEGFP+DOX组相比，pEGFP-MIPU1+DOX组中P53的mRNA表达受到抑制(图4)。

图4 RT-PCR检测过表达MIPU1对P53mRNA的影响Fig 4 Effect of MIPU1 over-expression on DOX-induced P53 changed levels by RT-PCR

2.5过表达MIPU1对DOX所致P53蛋白表达水平的影响

与pEGFP组相比，pEGFP+DOX组的P53蛋白表达增多；与pEGFP+DOX组相比，pEGFP-MIPU1+DOX组的P53蛋白表达受到明显抑制(图5)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP;#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX图5 Western blot检测过表达MIPU1对P53蛋白表达的影响Fig 5 Effect of MIPU1 over-expression on DOX-induced P53 changed levels by Westernblot(n=3)

2.6过表达MIPU1对DOX所致Bax在mRNA水平上表达的变化

与pEGFP组相比， pEGFP+DOX组中Bax的mRNA表达明显升高，当过表达MIPU1后Bax的mRNA表达明显受到抑制(图6)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX图6 RT-PCR检测 MIPU1转入HEK293细胞后观察Bax的mRNA水平变化Fig 6 The effect of MIPU1 over-expression on BaxmRNA and by RT-PCR(n=3)

2.7Westernblot检测过表达MIPU1对DOX所致Bax在蛋白水平上的表达变化

与pEGFP组相比，pEGFP+DOX组的Bax蛋白表达升高；而转入MIPU1后Bax蛋白表达受到明显抑制(图7)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；**Plt;0.01 compared with pEGFP+DOX图7 Western blot 检测MIPU1过表达对Bax蛋白变化的影响Fig 7 The effect of MIPU1 over-expression on Baxprotein by Western blot(n=3)

2.8过表达MIPU1对DOX所致Bcl-2在mRNA水平上的影响

与pEGFP组相比，pEGFP+DOX组的Bcl- 2的mRNA表达略有减少，但是转入MIPU1后即pEGFP-MIPU1+DOX组Bcl- 2的mRNA表达则明显增多(图8)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX图8 RT-PCR检测过表达MIPU1对Bcl- 2mRNA的影响Fig 8 The effect of MIPU1 over-expression on Bcl- 2mRNA by RT-PCR(n=3)

2.9过表达MIPU1在蛋白水平上对Bcl-2表达的影响

与pEGFP组相比，pEGFP+DOX组的Bcl- 2蛋白表达明显受到抑制；与pEGFP+DOX组相比，pEGFP-MIPU1+DOX组的Bcl- 2蛋白表达增多(图9)。

#Plt;0.05 compared with pEGFP；*Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX图9 Western blot检测过表达MIPU1对Bcl- 2蛋白表达变化的影响Fig 9 The effect of MIPU1 over-expression on Bcl- 2protein by Western blot(n=3)

3 讨论

DOX进入体内后能代谢为半醌类化合物，与核酸结合而导致DNA等发生损伤，从而起到杀伤肿瘤细胞的做用[3]。在整体动物水平上的阿霉素肾病模型中发现，DOX导致的肾脏毒性中细胞凋亡占了很大一部分的比例。凋亡是细胞的一种程序性死亡方式，对于自身的内环境稳态、发展和抵御病原微生物具有重要的作用[8]。Bcl- 2蛋白家族在细胞凋亡中发挥着重要的作用，这一家族根据功能的不同分成两大类：1)促进细胞凋亡的蛋白，包括Bax、Bak、Bid、Diva、Bim[9]、Bok和Bcl- XS[10]等。2)抗细胞凋亡的蛋白,包括Bcl- 2[11]、Bcl- XL、Bcl- W和Mcl- 1等。这两种蛋白的平衡被打破则参与到多种疾病的发病机制中。 P53的抑癌作用很强，当小鼠敲除P53基因后，发生癌症的概率达到百分之百[12]。DOX导致的氧化应激能激活细胞凋亡信号通路而导致细胞发生凋亡[13- 14]。

大鼠Mipu1是一个转录抑制因子，具有抗H2O2和TNF-α所致的细胞损伤的作用，其机制与抑制某些促凋亡基因的表达有关。人的MIPU1和大鼠的同源性很高，高达76%，但MIPU1是否在DOX所致的细胞损伤中也具有抗凋亡作用尚不清楚。

本次实验结果显示，DOX能诱导HEK293细胞发生凋亡，当过表达MIPU1后，细胞的存活率明显升高，凋亡率下降。进一步探讨其可能的分子机制发现， MIPU1能阻止DOX引起的Bcl- 2的下调，同时也能抑制DOX诱导的Bax的上调，使得Bax/Bcl- 2下降。因此MIPU1抗凋亡与促进Bax/Bcl- 2的下调有关。另外发现，过表达MIPU1还能抑制DOX处理下的P53在mRNA水平和蛋白水平上的表达，说明MIPU1在DOX诱导的细胞凋亡模型中发挥抗凋亡作用的途径不是单一的，而是多方面的，这为探究MIPU1的抗凋亡作用提供了新的理论依据。

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Overexpression of MIPU1 reducesdoxorubicin-induced apoptosis in human embryonic kidney 293 cells

SHI Chun-li1, JIANG Lei2, XIAO Xian-zhong2*

(1.Dept. of Clinical Laboratory, Hunan Maternal and Child Health Hospital;2.Dept. of Pathophysiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410008, China)

ObjectiveTo explore the affection of overexpression MIPU1 on DOX-mediated apoptosis and the mechanisms, so to provide novel insight into the biological functions of Mipu1, and a new clue for preventing the side-effects of DOX during anticancer implication.MethodsApoptosis was induced by Doxorubicin in this experiment. The eukaryotic expression plasmid pEGFP-MIPU1 was constructed previously and delivered into the cells to increase the expression of MIPU1. Firstly, MTT assay was used to estimate the cells viability. Then apoptosis was assessed by Hoechst staining and flow cytometry (FCM). Thirdly, Western blot and RT-PCR were performed to detect the expression of Bax, P53 and Bcl- 2 at the mRNA and protein levels respectively.ResultsAfter transfected with pEGFP-MIPU1, the overexpression of MIPU1 significantly attenuated the mortality rate induced by DOX (Plt;0.05vspEGFP+DOX), and markedly decreased the cellular apoptosis treated with DOX (Plt;0.01vspEGFP+DOX); The overexpression MIPU1 inhibited the increase of P53 and Bax induced by DOX (Plt;0.05vspEGFP+DOX), while reversed the decrease of Bcl- 2 expression in DOX-induced HEK293 cells (Plt;0.05vspEGFP+DOX).ConclusionsOverexpression MIPU1 inhibites apoptosis in HEK293 cells

induced by DOX, and MIPU1 may decrease the expression of P53 and Bax, and promote the expression of Bcl- 2 in DOX-induced HEK293 cells.

apoptosis; Doxorubicin; MIPU1; Bax; Bcl- 2

2014- 03- 06

2014- 05- 27

国家自然科学基金(30971205)；国家重点基础研究发展计划(2007CB512007)

*通信作者(correspondingauthor)：xiaoxianzhong@csu.edu.cn

1001-6325(2014)10-1352-06

R 363

A