hsa-mir-615过表达胰腺癌稳定细胞亚系的构建及功能初步验证

孙 洋，张婷婷，王翠萍，陈 杰*，赵 红

(中国医学科学院 北京协和医学院 1.国家心血管病中心 阜外心血管病医院 心血管疾病国家重点实验室 病理科;2.北京协和医院 病理科；3.北京积水潭医院 病理科, 北京 100730)

hsa-mir-615过表达胰腺癌稳定细胞亚系的构建及功能初步验证

孙 洋1,2，张婷婷2,3，王翠萍2，陈 杰2*，赵 红1

(中国医学科学院 北京协和医学院 1.国家心血管病中心 阜外心血管病医院 心血管疾病国家重点实验室 病理科;2.北京协和医院 病理科；3.北京积水潭医院 病理科, 北京 100730)

慢病毒(Lentivirus)载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达[1]。本实验在对胰腺癌差异表达的microRNA进行研究时发现hsa-mir-615在胰腺癌组织和胰腺正常导管上皮组织中呈现差异表达[2]，异常表达的microRNA可能具有生物学功能。因此，本实验构建hsa-mir-615过表达慢病毒载体并包装成慢病毒，感染人胰腺癌细胞MIA PaCa-2，建立hsa-mir-615过表达稳定细胞系，使用CCK-8法观察hsa-mir-615对胰腺癌细胞系生长的影响，为进一步研究hsa-mir-615的生物功能构建细胞模型。

1材料与方法

1.1 细胞系及包装病毒：胰腺癌细胞系MIA PaCa-2(American type culture collection，ATCC)。慢病毒包装细胞系为人类胚肾上皮细胞系293T细胞(中国医学科学院北京协和医院分子病理实验室保存)。慢病毒包装采用罗氏LV系统(Tronolab公司)，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G、Lenti-GFP-RNAi四质粒系统组成。

1.2 主要试剂及引物：RNA提取、反转录合成cDNA、qPCR及hsa-mir-615表达检测试剂盒(旷博公司)(Cat.0960602， Cat. 0960401，Cat. 0960211及Cat.0960302)。内切酶及连接酶(NEB公司产品)。转染使用罗氏FuGENE® HD转染试剂。

根据genbank及mirbase数据库[3]获取基因hsa-mir-615(Gene ID: 693200)序列，设计扩增引物：mir-615-F:5′-CTGT GTGCGCCCAAATTTACGACG-3′，mir-615-R:5′-CGGAATTC AGGGGTGAATAGCTTGCAGCGTTCC-3′

1.3 hsa-mir-615过表达慢病毒制备：采用PCR技术，以含有has-mir-615基因前体的人基因组DNA为模板扩增目的基因，连接入Lenti-GFP-RNAi载体后，转化入DH5α培养。PCR及测序鉴定细菌阳性克隆，扩增转化菌后提取含有mir-615DNA的Lenti-GFP-RNAi质粒, 按照说明书在293T细胞中制备慢病毒。

1.4 miR-615过表达稳转系建立及验证：将靶细胞分为未处理组(MIA PaCa-2)、mock组(MIA PaCa-2-pLTUGW-Mock)和mir-615组(MIA PaCa-2-pLTUGW-615)，分别感染PBS、空载病毒及含有mir-615DNA的病毒。感染48 h后，观察靶细胞荧光表达，流式细胞术检测感染效率，RT-qPCR法检测miR-615表达情况。

1.5 CCK-8法检测细胞活率：将未处理的MIA PaCa-2，Miapaca-2-pLTUGW-615和Miapaca-2-pLTUGW-Mock细胞均以3 000个细胞/孔接种于96孔板，于接种后24、48、72、96和120 h时更换为含10% CCK-8的培养基，37 ℃、 5% CO2的条件下培养1.5 h，检测波长为A450时的吸光度值。

2结果

2.1 hsa-mir-615过表达胰腺癌稳定细胞系的构建:hsa-mir-615DNA扩增(图1)、酶切、重组载体PCR鉴定，PCR产物带与预期目的分子大小一致。病毒感染MIA PaCa-2细胞48 h后，流式测定感染效率接近或超过90%。与对照细胞相比， MIA PaCa 2-pLUGW-mir-615 中mir-615过表达(图2)。由于慢病毒能够整合到细胞的基因组中，从而可以稳定地表达目的基因，据此构建稳定细胞系。

2.2 mir-615功能初步验证:用CCK-8法检测miR-615对胰腺癌细胞的生长情况的影响，相对于mock组， mir-615组从72 h开始即能够显著抑制MIA PaCa-2(图3)细胞的生长；与mock组相比， 72、 96、120 h抑制率分别为23.79%、 26.55%和38.67%(均Plt;0.05)。

1～3.hsa-mir-615; M.marker图1 hsa-mir-615扩增 Fig 1 Amplification of hsa-mir-615

*Plt;0.05 compared with MIA PaCa 2-pLUGW-miR-615图2 RT-qPCR鉴定mir-615过表达Fig 2 RNA expression of miR-615was assessedby RT-qPCR

3讨论

hsa-mir-615位于人类染色体12q13.13，存在于胚胎发育过程中重要转录因子HOX基因组群集区内。作为一个新发现的microRNA分子，关于miR-615的研究还比较少，本研究已经证实在胰腺癌组织中存在miR-615的成熟体miR-615-5p的低表达，并且使用瞬时转染的方法在体外研究发现miR-615的两个成熟体miR-615-5p和miR-615-3p对胰腺癌细胞均具有生长抑制作用。由于瞬时转染人工合成的 miRNA mimics在细胞内很容易被降解，不能实现稳定的miRNA 表达。为了能够长期稳定观察miR-615的功能，本实验使用慢病毒系统构建稳定过表达miR-615的胰腺癌细胞系。为下一步的功能实验提供稳定过表达miR-615的模型。

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with MIA Pala2-pLUGW-mir-615图3 未处理的Miapaca-2细胞Miapaca-2-pLTUGW-615细胞和Miapaca-2-pLTUGW-Mock细胞的生长曲线Fig 3 Cell survival analysis of MIA PaCa-2 cellsoverexpressing miR-615

为了研究miR-615基因的功能，使用CCK-8实验初步检验了miR-615组和mock组细胞的增殖情况，在相同数目铺板的情况下，本研究建立的miR-615稳定过表达的胰腺癌细胞的生长速度比mock组慢，自72 h起即具有统计学意义,这个结果与瞬时转染miR-615 mimic时对胰腺癌细胞的生长功能相一致。

本研究首次构建miR-615过表达的稳定细胞系，为miR-615用于胰腺癌的基因治疗迈出重要一步，为后续实验和临床治疗奠定了基础。

[1] Rubinson DA, Dillon CP, Kwiatkowski AV,etal. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference[J]. Nat Gene, 2003, 33: 401- 406.

[2] Backes C, Meese E, Lenhof HP,etal. A dictionary on microRNAs and their putative target pathways[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38: 4476- 4486.

[3] Griffiths-Jones S, Grocock RJ, Van Dongen S,etal. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature[J]. Nucleic Acids Res, 2006, 34: 140- 144.

2013- 12- 12

2014- 03- 25

国家自然科学基金 (30973470, 81172334)；国家科技支撑计划(十一五)项目 (2006BAI02A14)；卫生部卫生行业科研专项项目(200802011)

*通信作者(correspondingauthor)：xhblk@163.com

1001-6325(2014)10-1414-02

R 735.9

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