细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和血管内皮生长因子在骨巨细胞瘤中的表达及临床意义

黄永惠，叶顶琼，王运飞（四川省隆昌县人民医院：.肿瘤科；.神经内科 6450）

骨巨细胞瘤（GCT）是一种具有潜在侵袭及恶变的良性原发性肿瘤，主要发生于20～40岁的女性，据统计资料显示，我国GCT发病率高于西方国家［1］。GCT患者病灶主要位于骨骺，可扩展至干骺端甚至骨干。股骨远端、桡骨远端、胫骨近端、肱骨近端、骶骨为GCT常见的发病部位。GCT患者约80%为良性，25%～50%患者经治疗后复发，少数病情严重患者会发生肺转移，极少患者在放疗或复发后恶变。目前，临床上最常用Jaffe′s、Enennecking和Campanacci外科分期法来划分GCT肿瘤期限，但这些分级并不能准确预测GCT的生物学行为。因此，需要探寻一种有效预测GCT生物学行为及预后的相关检测指标［2］。本研究对细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）-CD147、血管内皮生长因子（VEGF）在GCT组织中的表达情况进行研究，并分析其与临床病理及预后的关系，旨在为临床准确判断GCT生物学行为及预后评估提供参考，为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料来源选择本院2010年2到2013年4月收治的GCT患者68例，其中男29例，女39例，年龄13～56岁，平均年龄（33.5±4.7）岁，均行手术治疗。其中8例行刮除；24例行刮除+骨移植；6例行切除+骨移植；16例行切除+人工关节置换；14例行切除+植骨。病变及取材部位：脊柱6例、尺骨2例、桡骨5例、股骨23例、胫骨10例、骶骨10例、髋骨5例、指骨7例。本研究选取的标本均经病理组织学证实为GCT并参照Jaffe′s外科分级标准［3］：Ⅰ级25例，Ⅱ级34例，Ⅲ级9例。入选标本均为患者手术过程中刮除或切除组织经10%中性甲醛固定，采用石蜡包埋，Ameritool公司生产的切片机4μm连续切片，并进行常规HE染色。

1.2 试剂及设备试剂免疫组化染色试剂盒（CW0118A），浓缩型DAB试剂盒（C0168），抗原修复液（SBT10001），兔抗人CD147（10186-RP01）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、VEGF多克隆抗体（HG10008-M）均购于北京中衫金桥公司；PBS（D3183）、苏木精（GT-5084）均购于西安科昊公司。Ameritool公司生产的切片机（DYQ-401K）、Olympus公司生产的显微镜（EXTECH-MC200）、Eppendorf公司生产的离心机（ROTOLAVTT细胞洗涤离心机）、GILSON公司生产的移液枪（Pipetman Ultra）、江苏南通金余公司生产的水浴箱（CJB-S 140mm×140mm）。Siemens公司生产的4℃冰箱（MBC-4V368）。

1.3 方法

1.3.1 S-P染色方法 石蜡包埋后，4μm连续切片，随后常规脱蜡置水。每张切片抗原修复处理3次，每次2min。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，每次5min，于室温下使用3%双氧水处理，时间为15min，以彻底将内源性过氧化物酶活性消除。再用PBS冲洗3次，每次5min，于室温下滴加5%山羊血清封闭液，保持30min，将多余的液体除去。加入一抗，CD147（1∶100）、MMP-2（1∶100）、MMP-9（1∶150）、VEGF（1∶100），将其置于4℃冰箱中过夜。于37℃下孵育1h。PBS冲洗，每张切片处理3次，每次5min，加入通用的二抗后处理30min。PBS冲洗，每张切片处理3次，每次5min，加入辣根酶表决链霉素卵白素液后处理30min。PBS冲洗，每张切片处理3次，每次5min，DAB试剂显色，并于显微镜下仔细观察，5～15 min后水洗并终止显色反应。苏木精复染，脱水，透明，封片。于高倍镜下观察每张切片，选取5个不同视野，观察阳性细胞的数量以及染色情况，阳性细胞为胞浆或胞膜浅黄色或棕黄色，综合阳性细胞数量以及染色强度进行分级［4］。阳性细胞所占百分比分级评分标准：1分（1%～25%）、2分（＞25%～50%）、3分（＞50%～75%）、4分（＞75%）；染色程度分级评分标准：0分（无色）、1分（浅黄 色）、2分（黄色）、3分（棕黄色）。上述阳性细胞所占百分比分级评分×染色程度分级评分后分为4个等级：0～1分为（-）、2～3分为（+）、4～5分为（++）、＞6分为（+++）。

1.3.2 胃癌微血管密度计数方法 GCT内任一的孤立棕黄色细胞或细胞簇均视为一条单独的血管，有无官腔以及红细胞并不作为判定为血管的必要条件，已经形成的肌层血管、分辨不清、染色模糊的细胞不计，于低倍镜下找到内含微血管最为丰富的肿瘤组织即“热点”，再于高倍镜下计数3个视野内的微血管数目，取其平均值分析。

1.4 统计学处理选择SPSS18.0软件包对数据进行统计分析，CD147、VEGF、MMP-9和患者性别、年龄、分级、预后之间的关系采用非参数秩和检验，CD147和VEGF、MMP-9、MMP-2表达的相关性采用Spearmen分析，检验标准为α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 染色结果分析 CD147于GCT组织中染色强度不一，单核机制细胞胞浆内和包膜上主要表达呈棕黄色颗粒状的阳性物质，多核巨细胞也会存在少量的表达。MMP-2、MMP-9主要表达于多核巨细胞，呈现胞浆着色，棕黄色为阳性物质，在部分单核基质细胞中也有一定的表达。VEGF阳性表达于细胞质内，多核和单核细胞内均有表达。

2.2 CD147、VEGF阳性表达和临床病理参数的关系分析

患者性别、年龄等一般情况与CD147、VEGF阳性表达无相关（P＞0.05）。各级Jaffe′s评级患者CD147和MMP-2阳性表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），预后各分组患者CD147、MMP-2、MMP-9阳性表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 Jaffe′s分级和预后和CD147、VEGF阳性表达的关系（n）

续表1 Jaffe′s分级和预后和CD147、VEGF阳性表达的关系（n）

2.3 CD147和VEGF阳性表达相关分析通过Spearman相关性分析，CD147的表达和MMP-9、VEGF的表达呈正相关（r=0.696，P=0.025；r=0.674，P=0.000）。

3 讨 论

GCT是一种常见的骨原发性良性肿瘤，具有一定的恶变能力，主要由单核细胞样细胞、单核基质细胞、多核巨细胞组成，但是上述细胞的起源和在肿瘤发生及发展过程中的相关作用还需临床进一步深入研究。另外，GCT发生和发展涉及众多细胞因子以及信号通路，其相关作用机制也尚未阐明。临床上治疗GCT首选方式为手术治疗，但术后患者仍存在复发及恶变的可能［5］。

1982年Biswas发现CD147属于免疫球蛋白超家族成员且广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白，为多效性分子，在胎儿的发育以及视网膜功能方面起着至关重要的作用，同时，胸腺T细胞的发展，淋巴细胞应答程序、组织重建、空间认知、精子发生等都有密切关系［6］。除了上述作用之外，CD147还在肿瘤的发生、发展以及侵袭转移过程中发挥着重要的作用，主要表现为以下几个方面。（1）促进肿瘤的侵袭和转移；（2）诱导肿瘤血管的生成；（3）促进肿瘤细胞的锚着非依赖性生长。CD147在肿瘤发展过程中还可以刺激并诱导MMP的生成，近年研究发现，CD147还能直接诱导肿瘤细胞产生MMP［7］。

体内外临床研究显示，CD147表达和VEGF诱导具有十分密切的关系，CD147过度表达时可刺激肿瘤生长及血管生成。对于CD147糖基化的研究报道显示，CD147功能和附着糖的类型与肿瘤存在直接联系，由此可推测细胞外基质在CD147糖基化过程中发挥着重要的作用，同时考虑到MMP的表达诱导也需要糖基化，由此提示，糖基化过程可能是调控CD147的重要机制，可作为今后治疗方向进行研究［8］。

近年来，越来越多的临床研究证实了肿瘤的组织学表现和生物学行为之间存在不一致性，Jaffe′s分级以及Enneking影像学分级虽具有判定GCT局部浸润的作用，但是无法预测其复发和转移。本研究结果显示，患者性别、年龄等一般资料与CD147、VEGF阳性表达无相关（P＞0.05）。由此说明患者年龄、性别不能作为判断GCT侵袭以及复发的指标。各级Jaffe′s患者CD147和MMP-2阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05），预后各分组患者CD147、MMP-2、MMP-9阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）。提示CD147、MMPs、GCT侵袭和预后有关，可作为临床评估GCT患者预后的重要参考指标。另外，CD147和VEGF、MMP-9等因子表达呈正相关，此结论和宫颈癌等肿瘤组织情况相似，由此提示CD147可能促进VEGF的表达，并通过降解细胞外基质和促进肿瘤血管生成，为肿瘤的增殖以及转移提供有利条件［8］。

综上所述，CD147的阳性表达和GCT患者病情恶化以及复发有着密切的关系，并且和MMP-9、VEGF的阳性表达密切相关，是目前临床上评价GCT恶性程度以及评估预后的重要检测指标。

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［2］Tsuji K，Ishikawa Y，Imamura T.Technique for differentiating alveolar soft part sarcoma from other tumors in paraffin-embedded tissue：comparison of immunohistochemistry for TFE3and CD147and of reverse transcription polymerase chain reaction for ASPSCR1-TFE3fusion transcript［J］.Hum Pathol，2012，43（3）：356-363.

［3］Le Floch R，Chiche J，Marchiq I，et al.CD147subunit of lactate／H+symporters MCT1and hypoxia-inducible MCT4is critical for energetics and growth of glycolytic tumors［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（40）：16663-16668.

［4］de Oliveira AT，Pinheiro C，Longatto-Filho A，et al.Coexpression of monocarboxylate transporter 1（MCT1）and its chaperone（CD147）is associated with low survival in patients with gastrointestinal stromal tumors（GISTs）［J］.J Bioenerg Biomembr，2012，44（1）：171-178.

［5］韩跃虎，杨柳，黄景辉，等.CD147、PCNA、VEGF和MMPs在骨巨细胞瘤中的表达及临床意义［J］.中国骨与关节外科，2012，5（1）：65-71.

［6］柳忠兴，于秀淳.CD147和Survivin在骨巨细胞瘤中的表达及其临床意义［J］.中国骨与关节杂志，2012，1（3）：253-257.

［7］刘焕彩，刘金兰，孟晓光，等.骨巨细胞瘤组织中MMP-2、E-cadherin的表达变化及意义［J］.山东医药，2011，51（42）：93-94.

［8］李翀，李海，冯一中.骨巨细胞瘤中Skp2、p27及E2F-1的表达及意义［J］.临床与实验病理学杂志，2011，27（11）：1202-1205.