TGFβ1T29C多态性与NSCLC易感性及放射敏感性的相关性研究

黄友为，周光华

(湖南师范大学第二附属医院，解放军第163 医院，湖南 长沙 410003)

转化生长因子β1 (TGFβ1)是人体内一种维持内平衡的重要多效细胞因子，其主要作用是调节炎症、免疫反应、细胞生长及分化，诱导上皮间质化(EMT)发生和肿瘤血管生成，调控细胞增殖和凋亡等。TGFβ1 广泛表达于正常组织及肿瘤组织，在早期肿瘤组织中起抑制癌细胞生长、迁移，表现为抑癌作用;而在晚期肿瘤中促进肿瘤组织生长，与肿瘤发展、预后相关［1］。当TGFβ1 编码区第29 位核苷酸由T 突变为C，引起密码子10 编码的氨基酸从Leu变成Pro，不仅影响了该细胞因子的血浆含量，还导致其功能的改变［2，3］。许多研究表明，TGFβ1 T29C多态性与肿瘤疾病密切相关，尤其集中在乳腺癌、胃癌，但也有不少研究认为它们之间无明显相关性，随着越来越多的最新研究加入，TGFβ1 T29C 多态性与肿瘤相关性得到肯定。TGFβ1 T29C 多态性与非小细胞肺癌(NSCLC)之间的相关性研究目前国内外报道不多，本研究通过比较对照组与NSCLC 组TGFβ1 T29C 等位基因分布情况，探讨TGFβ1 T29C单核苷酸多态性(SNP)与NSCLC 易感性是否存在相关性，同时进一步研究该位点与NSCLC 的放射敏感性是否存在相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象的选择

收集60 例(31 例男性，29 例女性，平均年龄为65.6 岁)2013年5月～2013年10月在湖南师范大学第二附属医院肿瘤中心病理确诊为ⅢB 期NSCLC患者的血样(5mL)，所有患者放疗前未行其它治疗。同时收集62 例(32 例男性，30 例女性，平均年龄为62.5 岁)2013年9月在湖南师范大学第二附属医院进行体检的健康人的血样(5mL)作为对照组，对照组排除患有心血管疾病、肾脏疾病、风湿病、糖尿病等其他可能导致假阳性结果的人群。肺癌组与对照组成员均为湖南省长沙地区汉族人。

1.2 实验方法与判断标准

DNA 提取:采用OMEGA(D3471-02)全血基因组提取试剂盒按照说明书步骤提取外周静脉血白细胞DNA。

引物的合成:引物合成及PCR 产物测序由武汉华大基因公司完成。TGF-β1 T29C 上游引物为:5'-CCC TAT TCA AGA CCA CCC A-3'，下游引物为:5'-GCC AGT CAC TTC CTA CCC G-3'。

目的基因扩增:PCR 反应体系为50 μL，包括ddH2O 37.5 μL，10mM dNTP 1μL，10 ×PCR buffer 5 μL，25mM Mgcl2 3 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR 扩增条件:94℃变性1min，58℃退火50sec，72℃延伸1min30sec，进行40 个循环，然后72℃延伸10min 后4℃保温。最后PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR 产物测序步骤:①测序DNA 模板的纯度与用量:DNA 纯度:OD260/OD280 =1.6 ～2.0。使用酒精/NaAc 法在测序前对PCR 产物进行纯化，然后再进行DNA 测序的PCR 反应。②质粒和PCR 产物测序:反应体系为20μL，包括引物1μL，DNA 模板1μL，BigDye 8μL，灭菌去离子水10μL。测序PCR热循环条件:96℃1 min→(96 ℃10 sec→50 ℃5 sec→60 ℃4 min)×25 个循环→4 ℃保温。③测序产物纯化:20 μL 反应体系，酒精/EDTA/NaAc 法纯化后使用ABI3730xl 测序仪测序。

观察指标:TGFβ1T29C 基因TT、TC、CC 基因型及T、C 等位基因频率分布情况。并统计TGFβ1 29位点多态性在肺癌组与对照组的分布，分析肺癌组TGFβ1 29 位点多态性与放射敏感性的关系 依据放疗前后患者胸部CT 检查测量放疗前后肿瘤大小，计算肿瘤缩小百分比。疗效评价标准按照WHO 制定的标准分为有效和无效两组，有效组包括完全缓解(CR)和部分缓解(PR)，无效组包括稳定(SD)和进展(PD)。

1.3 统计学处理

应用双侧卡方检验比较NSCLC 组与对照组的TGFβ1 基因29 位点频率分布差异，用以评估TGFβ1 SNP 与NSCLC 易感性的相关性。统计NSCLC 患者放疗前后肿瘤缩小百分比，应用双侧卡方检验比较NSCLC 患者TGFβ1 基因29 位点频率分布与疗效的相关性，用以评估TGFβ1 SNP 与NSCLC 放射敏感性的相关性。所有统计分析采用SHEsis 和SPSS 13.0 统计软件处理。

2 结果

2.1 Hardy-weinberg 平衡检验结果

结果发现肺癌组和对照组χ2值分别为0.258和0.003(P ＞0.05)，符合Hardy-weinberg 平衡，具有群体代表性。

2.2 TGFβ1 T29C PCR 扩增产物电泳图及各表型测序图

图1 扩增胶图，1%琼脂糖凝胶电泳，3μL 上样量，MARKER 为DL2000 PLUS

图2 TGFβ1 T29C 各表型测序图(分别为CC、TC、TT 型)

2.3 TGFβ1 基因29 位点多态性在NSCLC 组和对照组的分布

由表1 可见，NSCLC 组和对照组的T 与C 等位基因频率分别为51.7%、58.1%和48.3%、41.9%。NSCLC 组的T 等位基因频率略低于对照组，C 等位基因频率略高于对照组，但经统计学分析两组无显著性差异(χ2=1.008 P ＞0.05)。

表1 TGFβ1 基因29 位点等位基因在非小细胞肺癌组和对照组的分布频率

两组的TGFβ1 基因型分布见表2。NSCLC 组的TT、TC、CC 基因型频率分别为28.3%、46.7%及25.0%。对照组的TT、TC、CC 基因型频率分别为33.9%、48.4%及17.7%。NSCLC 组中CC 纯合子基因型的频率要高于正常组，TT 基因型要低于健康对照组，但两组之间的差异尚不显著(P ＞0.05)。CC 基因型相对于TT 基因型患肺癌的OR(相对风险度)为0.59(95% CI:0.22 ～1.63)，TC 基因型相对于TT 基因型患肺癌的OR 为0.87(95% CI:0.38～1.97)，C 等位基因OR 为1.30(95% CI:0.78 ～2.15)。

表2 TGFβ1 基因29 位点基因型分布情况

2.4 NSCLC 组TGFβ1 基因29 位点多态性与放射敏感性的关系

从表3 可以看出，不同TGFβ1 基因29 位点基因型的NSCLC 患者对放疗的有效率不尽相同，TC基因型的患者对放疗的有效率低，仅为28.6%，其次为CC 基因型，为50.0%，而TT 基因型的患者对放疗的有效率较高，为64.7%，三者之间的差异有统计学意义(χ2=6.125 P ＜0.05)。

表3 不同基因型非小细胞肺癌患者放疗的疗效比较

3 讨论

TGFβ1 自1972年发现以来，其相关研究取得了很大进展。TGFβ1 基因定位于19q13.1，cDNA 全长2745 bp，含7 个外显子和6 个内含子［4］。TGFβ 主要通过TGFβ/SMAD 信号通路发挥作用，TGFβ(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)在多数细胞类型中与膜受体TGFβR1(ALK5)、TGFβR2 结合，活化的TGFβ 受体使其位于羧基端的丝氨酸磷酸化，SMAD 蛋白(SMAD2、SMAD3、SMAD4)就形成二聚体，直接转运至细胞核，行使转录因子的功能，最终表现出细胞生长抑制及凋亡;在内皮细胞中，TGFβ 与ALK1 膜受体结合，激活胞内SMAD1、SMAD5 作用于细胞核，从而影响细胞增殖、迁移［5］。此外，TGFβ 还存在非SMAD 信号通路，包括Erk，JNK/p38 ，RhoA，PI3K/AKT 等［6］。TGFβ1 SNP 与肿瘤易感性的相关性研究结果一直处于矛盾状态。不少研究显示，TGFβ1 29 位点为C/C 型的TGFβ1 分泌量明显高于T/T型［3，7］，TGFβ1 T29C/C 型患肿瘤的风险显著升高［5，8，9］。然而也有学者得到相反的结果［3，10］，这种矛盾的现象可能是TGFβ 双重作用所致，即TGFβ 减少早期肿瘤的发生风险，促进肿瘤的进展［3］。不同区域、人群之间TGFβ1 T29C 基因型分布各不相同［7，11］，本实验结果显示，湖南地区汉族人TGFβ1 T29C 基因型分布情况与其他省份地区相差不大［12］;湖南地区汉族人TGFβ1 T29C 的多态性与NSCLC 的易感性之间无显著相关性，与Lu Bai 等人［13］研究辽宁省汉族人群TGFβ1 T29C 的多态性与NSCLC 易感性的结果相同。

TGFβ1 T29C 多态性与肺癌进展及预后存在相关性，Xianglin Yuan 等人回顾性研究发现TGFβ1 T29C CT/CC 基因型NCSLC 患者有更差的远处转移率及头部转移率，同时他们通过慢病毒转染A549和PC9 细胞体外实验发现C 等位基因型对比T 型有更强的活力及侵袭性，TGFβ1 29C 基因型细胞具有很强的转移及侵袭潜能［14］。 Mukaddes ColakogμLlari 等人［15］进行土耳其人群肺癌患者与健康人对照临床研究发现，TGFβ1 的T29C 多态性与肺癌患者的生存时间密切相关，T/T 基因型患者较C/C 基因型患者生存时间长。C 基因携带者具有更强的进展风险及更差的预后，可能导致C 基因携带者对放疗疗效不佳。本研究结果表明，TGFβ1 29 位点单核苷酸多态性与NSCLC 患者的放射敏感性具有相关性，其中TT 患者对放疗敏感，而CT 和CC 患者对放疗敏感性较差。但限于本实验病例数较少，仍需进一步大样本临床研究验证，以期通过检测放疗患者的TGFβ1 T29C 不同基因型的方法来选择不同剂量强度，以达到个体化治疗的目的。

［1］Massagué J.TGFbeta in Cancer［J］. Cell，2008，134(2):215-230.

［2］Yokota M，Ichihara S，Lin TL，et al. Association of a T29→C polymorphism of the transforming growth factor-beta1 gene with genetic susceptibility to myocardial infarction in Japanese［J］. Circlation，2000，101(24):2783-2787.

［3］Taubenschuβ E，Marton E，Mogg M，et al. The L10P polymorphism and serum levels of transforming growth factor β1 in human breast cancer［J］.Int J Mol Sci，2013，14(8):15376-15385.

［4］于才红，吕爱莲，符晓华等.转化生长因子β1 与绝经后妇女高血压的相关性研究. 湖南师范大学学报(医学版)，2006，3(4):13-20.

［5］Scollen S，Luccarini C，Baynes C，et al. TGF-β signaling pathway and breast cancer susceptibility［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20(6):1112-1119.

［6］Zhang YE. Non-Smad pathways in TGF-β signaling［J］. Cell Res，2009，19(1):128-139.

［7］Dunning AM，Ellis PD，McBride S，et al. A transforming growth factorbeta1 signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer. Cancer Res，2003，63(10):2610-2615.

［8］Guo W，Dong Z，Guo Y，et al.Polymorphisms of transforming growth factor-b1 associated with increased risk of gastric cardia adenocarcinoma in north China［J］. Int J Immunogenet，2011，38(3):215-224.

［9］Cai Q，Tang Y，Zhang M，et al.TGFβ1 Leu10Pro polymorphism contributes to the development of prostate cancer:evidence from a metaanalysis［J］.Tumour Biol，2014，35(1):667-673.

［10］Ziv E，Cauley J，Morin PA，et al. Association between the T29→C polymorphism in the transforming growth factor beta1 gene and breast cancer among elderly white women:The Study of Osteoporotic Fractures［J］. JAMA，2001，285(22):2859-2863.

［11］Jin Q，Hemminki K，Grzybowska E，et al. Polymorphisms and haplotype structures in genes for transforming growth factor beta1 and its receptors in familial and unselected breast cancers［J］. Int J Cancer，2004，112(1):94-99.

［12］孙卫文，车坤兰，陈盛强. 143 例广东籍汉族人转化生长因子TGFβ1 T869C 基因多态性检测.现代医院，2010，l0(5):19-21.

［13］Bai L，Yu H，Wang H，et al. Genetic single-nucleotide polymorphisms of inflammation-related factors associated with risk of lung cancer［J］.Med Oncol，2013，30(1):414.

［14］Yuan X，Wei Q，Komaki R，et al. TGFβ1 Polymorphisms Predict Distant Metastasis-Free Survival in Patients with Inoperable Non-Small-Cell Lung Cancer after Definitive Radiotherapy［J］. PLoS One，2013，8(6):e65659.

［15］Colakogullari M，Ulukaya E，Yilmaztepe Oral A，et al. The involvement of IL-10，IL-6，IFN-gamma，TNF-alpha and TGF-beta gene polymorphisms among Turkish lung cancer patients［J］. Cell Biochem Funct，2008，26(3):283-290.