TGF-β1对鼠肌成纤维细胞增殖和分泌1型胶原的影响

邓长柏，贺 亮，孙凤杰，李 娟

(广州医科大学附属第五医院儿科，广东 广州 510700)

支气管肺发育不良(bronchial pulmonary display，BPD)是早产儿常见的疾病，随着早产儿发生率的增加和机械通气应用的增多，BPD 患儿也越来越多，其病理表现为肺血管的发育障碍和肺的纤维化。肺纤维化表现为肺泡细胞破坏和间质细胞(成纤维细胞)增殖，分泌更多的细胞外基质。多种因素可导致成纤维细胞活化增殖，其中转化生长因子β1(transforming growth factors-β1，TGF-β1)是最主要的细胞因子，其致肺纤维化的作用机制值得研究。本文采用培养的成纤维细胞株C212，经TGF-β1 干预，检测其细胞增殖和分泌细胞外基质，研究其作用机制，具有一定作用。

1 材料和方法

1.1 试剂、仪器

DMEM 培养液(Hyclone 公司生产)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司产品)，TGF-β1 试剂为美国Peprotech 公司生产(1μg/mL)，辣根过氧化物酶，羊抗免IgG 2 抗体(博士德公司生产)(－4℃保存)，胰酶，牛血清白蛋白(BSA)、DEPC、PMSF 和考马斯亮兰R-250 均购于美国Sigma 公司，MTT(250mg/支、Amresco 公司生产，配成5mg/mL 的MTT/PBS 溶液)，3H-Thymidine:(购于中国原子能研究所，0.2μCi/μL)。3350 型酶联免疫检测仪(德国Beckman 公司生产)，LS6500 型液体闪烁计数器(德国Beckman 公司生产)，6 孔培养板、96 孔培养板、24 孔培养板(均为美国Costar 公司生产)。Ⅰ型胶原ELISA 试剂盒(美国Metra CICP，Quidel Corporation 生产)，逆转录试剂盒(Revert Aid K1621，Fermentas 公司生产)，Trizol 试剂(TRI-Reagent，美国GiBCO 生产)，引物(华大基因-上海鼎安生物公司生产)，Taq 酶(100u/支)(Promega 公司生产)。主要仪器:CO2培养箱(美国SHEL-LAB 公司生产)，医用净化工作台(YJ-875，苏州净化设备公司生产)，倒置显微镜(Olympus 公司生产)，图像分析系统(美国Bio-Rad 公司生产)，PCR 扩增仪(美国Perkin Elmer 公司生产)，凝胶影像分析仪(Jeldoc 2000型，美国Bio-Rad 公司生产)，γ 射线计数仪(中科院核物理研究所生产)。

1.2 试验方法

鼠肺成纤维细胞株C2C12 细胞培养:C2C12 细胞系(由中南大学病理生理教研室提供)，用含10%小牛血清的DMEM 培养液培养于37℃，5%CO2，恒温、恒湿培养箱中培养，制备细胞悬液进行实验。

MTT 测定TGF-β1 作干预后的细胞增殖:制成单细胞悬液后，以每孔1 ×104个细胞接种于96 孔培养板中，每孔体积200μL。将培养板放入CO2培养箱，在37℃、5%CO2及恒温恒湿条件下，培养24 h;用无血清的DMEM 培养液洗细胞1-2 次;加无血清DMEM 培养液和TGF-β1(使终浓度成0、1、5、10ng/mL)，再培养24 h;加入MTT 溶液(5mg/mL)20μL/孔37℃继续培养4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液。再在每孔中加入DMSO 150μL，振荡10min，使甲臜充分溶解。选择490nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果(OD值)。每一浓度做5 个复孔，计算平均值。

3H-Thymidine 测定TGF-β1 干预后细胞增殖:制成单细胞悬液后，以每孔1 ×104个细胞接种于24孔培养板中，每孔1mL。将培养板放入CO2培养箱，在37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱中培养24 h;用无血清DMEM 培养液洗细胞1 ～2 次;加无血清DMEM 培养液和TGF-β1(使终浓度成0、1、5、10ng/mL)再培养24 h;在每孔加入3H-Thymidine 5μL(1μCi/孔);继续培养8h，取出培养板，用Hanks 溶液洗涤2 次;在每孔加入2mL 预冷10%三氯乙酸洗涤;在4℃下放置5 min，共2 次。吸去上清液，再在每孔加入0. 5 mL 0. 3M NaOH;在60℃下放置30 min，混匀，移入闪烁瓶中;每瓶加入3 mL 闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(CPM)。每一浓度做5 个复孔，计算平均值。

Ⅰ型胶原的检测:不同浓度(0、1、5、10 ng/mL)TGF-β1 干预细胞24 h，抽提RNA，做RT-PCR(具体步骤按分子生物学试验指南);取细胞培养上清液用ELISA 检测Ⅰ型胶原，方法步骤按ELISA 试剂盒操作说明进行。

表1 Ⅰ型胶原PCR 引物序列和产物长度

1.3 统计方法

计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析F 检验，多组间两两比较采用方差分析SNK-q 检验，P ＜0.05 为差别有显著性统计学意义。采用SPSS 11.5 for windows 统计分析软件进行统计学处理，分析前均进行了方差齐性检验。

2 结果

2.1 TGF-β1 干预细胞增殖

0、1、5、10ng/mL TGF-β1 干预细胞24 h，促进细胞增殖。其MTT(OD 值)分别是0. 096、0. 177、0.240、0. 312;［3H］(cpm/min)分别是630、907、1493、1808，随着TGF-β1 浓度增大，其MTT 值和［3H］值也相应增大。详细结果见表2。

表2 TGF-β1 干预细胞增殖结果

2.2 TGF-β1 对细胞分泌和表达Ⅰ型胶原影响

0、1、5、10 ng/mL TGF-β1 干预C2C12 细胞24 h，用ELISA 法检测Ⅰ型胶原结果(CICP、ng/mL)为616、713、783、853;半定量RT-PCR 检测Ⅰ型胶原/β-actin 光密度比值分别是0.93、1.83、2.50、2.94。随着TGF-β1 作用浓度增加而表达增强，呈剂量依赖性。具体结果见表3。

表3 TGF-β1 干预细胞24 h Ⅰ型胶原分泌和表达结果

3 讨论

随着早产儿出生率的增加，BPD 的发生也有增加。对于BPD 的发病机制的研究可以帮助我们更好认识该疾病的发生发展，为预防和治疗提供策略。2005年中国新生儿学会流行病学报道我国城市早产儿出生率高达7. 76% (国外报道多在4% ～9%)，BPD 的研究势在必行。BPD 的发病机制是多因素的，早产是其首要因素，胎龄大于32 周的早产儿极少发生BPD，出生体重和胎龄是其发生最重要的预测因素［1］;其次，机械通气和氧毒性是其发生的另一因素，避免过多的用氧和机械通气可减少其发生率和严重程度［2］;炎症和感染也是其重要的发病因素，炎症因子和抗炎因子扮演着重要的角色，是公认的致纤维化的细胞因子，研究表明BPD 胎儿猴肺TGF-β1 明显增加［3］。但TGF-β1 在BPD 发病中的作用和机制不清，有研究报道TGF-β1 可使支气管内皮细胞向间质细胞转化，肿瘤坏死因子加剧其转化，导致肺纤维化［4］。TGF-β1 对肺成纤维细胞增殖和1 型胶原分泌的具体研究国内报道较少，本文通过TGF-β1 对小鼠肺成纤维细胞的干预，发现其细胞生长呈现剂量依赖性，随着TGF-β1 浓度的增加而增加;其分泌1 型胶原及其基因表达也呈剂量依赖性，随着TGF-β1 浓度的增加而增加。通过此实验研究说明TGF-β1 在致纤维化的过程中起直接的作用。多种因素可以导致TGF-β1 升高，Sakurai研究发现高氧引起的肺损伤时TGF-β1 升高，阻断TGF-β1 信号通路可以阻滞其肺损伤，减轻纤维化［5］。因此，阻断TGF-β1-成纤维细胞增殖信号通路可能成为早产儿BPD 的治疗靶标，为防治BPD的发生发展提供理论依据，因此该实验研究具有一定的临床意义。

［1］Ambalavanan N，Walsh M，Bobashev G，et al. Intercenter differences in bronchopulmonary dysplasia or death among very low birth weight infants［J］. Pediatrics，2011，127(1):106-116.

［2］Jobe AH. The new bronchopulmonary dysplasia［J］.Curr Opin Pedistr，2011，23(2):167-172.

［3］Tarantal AF，Chen H，Shi TT，et al. Overexpression of transforming growth factor-beta1 in fetal monkey lung resultins in prenatal pulmonary fibrosis［J］.Eur Respir J，2010，36(4):907-914.

［4］Kamitani S，Yamaauchi Y，Kawasaki S，et al. Simultaneous stimulation with TGF-β1 and TNF-ɑ induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epihelial cells［J］. Int Allergy Immounol，2011，155(2):119-126.

［5］Sakurai R，Li Y，Torday JS，et al.Curcumin augments lung maturation preventing neonatal lung injury by inhibiting TGF-β1 signaling［J］. Am J Physion Lung Cell Mol Physiol，2011，301(5):L721-730.