小檗碱对酒精所致心肌细胞凋亡的影响研究

刘 慧，朱俐俐，李 玲

(湖南师范大学医学院第二附属医院，中国人民解放军第163 医院综合内科，湖南 长沙 410003)

随着生活质量的提高，酒成了人们必不可少的饮品，一般一次大量摄入酒精或长时间摄入才会对身体产生严重影响，所以人们很大程度上忽视了酒精对人体的损伤。随着饮酒量的增加，可出现明显的心肌损伤，导致心功能障碍，猝死风险很高［1］。大量研究发现小檗碱(berberine，BBR)对心血管有多种药理作用，关于小檗碱用于扩血管、抗心律失常、抗心力衰竭、抗动脉粥样硬化等作用多有报道［2］，但对酒精性心肌损伤的干预尚未见报道。本研究在建立酒精性心肌损伤大鼠模型的同时予以小檗碱干预，探讨小檗碱对酒精引起心肌凋亡的影响及可能机制。为小檗碱预防酒精性心肌损伤提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

成年雄性SD 大鼠SPF 级30 只，体重约250 ～300g，购自中南大学动物实验学部。56%白酒(北京红星股份有限公司生产的红星二锅头酒)，小檗碱20 mg /片(东北制药总厂生产)，cTnT 试剂盒(美国Boehringer Mannheim 公司)、CPK(南京建成生物有限公司产品)、CRP 试剂盒(北京科美生物技术有限公司)。

1.2 方法

将成年雄性SD 大鼠34 只随机分为3 组，对照组10 只，酒精组12 只，保护组12 只，酒精组及保护组予以用56%白酒灌胃，第1 周每天给酒5mL/kg，1 次灌胃，同时给予10%的乙醇随意饮用;第2 周每天给酒10 mL/kg，分2 次灌胃，同时给予10%的乙醇随意饮用;第3 周每天给酒10 mL/kg，分2 次灌胃，同时给予20%的乙醇随意饮用;第4 周每天给酒15 mL/kg，分3 次灌胃，同时给予20%乙醇随意饮用，直至12 周，对照组给予等量蒸馏水灌胃，保护组同时予以小檗碱200 mg/kg/d 灌胃12 周。12 周后取大鼠腹腔干血，低温离心，制备血清，采用全自动生化分析仪系统检测血清中CK、乳胶增强免疫比浊法检测CRP 的含量，酶联免疫法测定CTnT 水平。取大鼠心脏中段，10%甲醛溶液固定，做常规石蜡切片，进行HE 染色，观察心肌病理学变化。剪取50 ～80mg 大鼠心脏组织放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，按步骤加入各试剂，提取各组心肌组织总RNA。将其逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，将待测样品和内参样品同时进行PCR 扩增，根据待测样品和内参样品扩增产物电泳灰度的比值估算其mRNA 表达的相对量。

1.3 统计分析

采用SPSS13.0 软件，所得数据均用mean ±SD表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两组间的比较采用t 检验，均数之间两两比较采用q 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清CTnT、CK、CRP 含量的比较

与对照组相比较，酒精组血清CTnT、CK、CRP含量增多(P ＜0.05);与酒精组对比，保护组血清CTnT、CK、CRP 含量减少(P ＜0.05)(见表1)。

表1 大鼠血清CTnT、CK、CRP 含量

2.2 各组心肌病理组织学改变

正常对照组显微镜下心肌细胞结构完整，细胞浆红润，细胞核完整，排列整齐，心肌纤维排列正常、无断裂，无细胞间质炎细胞浸润。酒精组显微镜下与正常组比较心肌细胞不均匀肥大、延伸、变形，核大，心肌纤维排列紊乱，心肌间质纤维化，可见炎细胞浸润。保护组显微镜下部分心肌细胞肥大，排列紊乱，心肌间质未见明显纤维化，少量炎性细胞浸润(图1)。

图1 对照组、酒精组及保护组心脏病理切片HE 染色(×400)

2.3 各组大鼠心肌组织Bcl-2 及Bax 的mRNA 水平检测

由表2、图2、3 可见，与对照组比较，酒精组大鼠心肌组织Bcl-2 表达水平增加不明显，Bax 表达水平显著增高(P ＜0.05)，Bcl-2/Bax 比值减小(P ＜0.05);保护组与酒精组比较，心肌组织Bcl-2 表达水平增强(P ＜0. 05)，Bax 表达水平减弱(P ＜0.05)，Bcl-2/Bax 比值增大(P ＜0.05)。

表2 心肌组织Bcl-2 及Bax 的mRNA 水平检测结果

图2 Bcl-2 mRNA 在各组心肌中的表达

图3 Bax mRNA 在各组心肌中的表达

3 讨论

乙醛是乙醇的代谢产物，可通过损伤线粒体功能、降低肌丝Ca2+通道敏感性、氧化损伤及等造成心肌的损害［3］。CK 主要存在骨骼肌、心肌和脑组织中，血清中的肌酸磷酸激酶升高，说明组织中有细胞坏死。CTnT 是主要分布于心肌内部，当心肌存在炎症或损伤，它释放入血液，是诊断心肌损伤最高的标志物。CRP 是组织损伤的一种非特异性反应，在正常血清中其含量极微，当组织受到损伤、炎症、感染或肿瘤破坏时CRP 可以在数小时内急剧上升。现大部分研究表明CRP 参与了动脉粥样硬化心血管疾病，对心血管疾病的危险评估有着很强的预示作用。本实验所得心肌损伤指标CTnT、CK、CRP 含量在酒精组显著增高，而保护组上述指标只有轻度升高，说明12 周时酒精可造成心肌的损害，且小檗碱适当的减轻了酒精所造成的心肌损伤［4-7］。

HE 染色可见，酒精组大鼠心肌细胞不均匀肥大，核大，心肌纤维排列紊乱，心肌间质炎细胞浸润，心肌细胞变性。与酒精组比较，保护组大鼠心肌结果有明显改善，显微镜下肌纤维较规则，部分心肌细胞肥大，排列紊乱，只有少量心肌间质炎性细胞浸润。实验结果说小檗碱对酒精所导致的心肌结构损伤有保护及重塑作用。

细胞凋亡是指在活体组织中某些细胞在一定体内外因素影响下通过其自身基因调控而发生的一种细胞主动死亡过程。有研究表明，即使早期无明显心肌受损，凋亡前机制也已被激活［8］。由于细胞凋亡和缺失，心肌重塑，则出现随后的心肌细胞肥大，心脏代偿性增大，心功能降低［9-10］。Bcl-2 是早期的抗凋亡基因，是制约细胞凋亡的重要因素，存在于核膜、线粒体膜及细胞膜的表面，能和家族成员凋亡相关基因Bax 形成异源二聚体调节细胞的凋亡，Bcl-2/Bax 基因的比值可用于评判细胞凋亡的程度［11-12］。本实验可见酒精组凋亡相关基因Bax mRNA 表达水平明显增强，Bcl-2 与Bax 比值较对照组明显降低，凋亡发生率明显高于对照组，表明酒精可通过加速细胞凋亡相关基因Bax 的表达诱导细胞的凋亡。与酒精组比较，保护组凋亡相关基因Bcl-2 mRNA 表达水平显著增强，Bcl-2/Bax 比值较酒精组升高，说明保护组细胞凋亡的发生率比酒精组低，小檗碱可通过作用抗凋亡蛋白的表达而减少细胞凋亡。

综上所述，慢性酒精摄取可以引起心肌细胞的凋亡，且心肌细胞的凋亡与Bcl-2、Bax 的表达有关，小檗碱可通过调节Bcl-2、Bax 的表达从而起到保护心肌的作用，但是小檗碱如何启动Bcl-2、Bax 的表达及其具体调控机制尚不清楚，需进一步研究。

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