腺病毒rhBMP-2转染兔BMSCs复合同种异体脱钙骨基质的生物相容性研究*

蔡伟良，李 强，宁寅宽，武成聪，陈佳滨，石正松

(桂林医学院附属医院骨二科，广西桂林 541001)



腺病毒rhBMP-2转染兔BMSCs复合同种异体脱钙骨基质的生物相容性研究*

蔡伟良，李 强△，宁寅宽，武成聪，陈佳滨，石正松

(桂林医学院附属医院骨二科，广西桂林 541001)

目的 探讨腺病毒重组人骨形态发生蛋白-2(Ad-rhBMP-2)转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合同种异体脱钙骨基质(DBM)的生物相容性。方法 参照Urist方法制得兔同种异体DBM材料，免疫组化观察转染后BMSCs内BMP-2表达情况；转染48 h后复合同种异体DBM上，扫描电镜观察细胞生长、贴附情况，MTT法检测细胞增殖情况。结果 腺病毒转染48 h后，BMSCs能够表达BMP-2，扫描电镜可见转染后的细胞在DBM上贴附良好并且大量增殖。MTT检测结果显示，种植于DBM上的转染后细胞增殖情况正常，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Ad-BMP-2转染BMSCs与同种异体DBM的生物相容性良好。

骨形态发生蛋白质类；腺病毒科；骨髓；间质干细胞；脱钙骨基质

现代临床医学中，由于不同原因引起的骨质缺损和骨质坏死依然是亟待解决的问题之一。目前临床上应用于骨重建可用的材料包括自体骨移植、异体骨移植和人工合成骨替代物。由于自体骨有限、异体骨移植存在免疫及疾病传播的风险及人工合成替代物疗效不明显的不足，因此，组织工程骨成为另一种解决骨组织缺损、坏死、延迟愈合的方法。组织工程骨中3个核心要素为种子细胞、支架材料和细胞因子。骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其取材创伤小、易于分离培养，是目前热门的种子细胞之一[1]。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)在骨修复过程中可促进成骨细胞增殖、基质分泌和血管化[2-3]。脱钙骨基质 (demineralized bone matrix,DBM)来源于骨组织，具有理想的孔隙结构，并有良好的降解性。本实验以兔DBM为支架，以腺病毒为载体介导BMP-2转染BMSCs接种于DBM，观察和探讨DBM植骨材料作为BMP-2基因转染后BMSCs支架的生物学相容性，为临床上骨缺损的修复做进一步实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)BMSCs：兔BMSCs来源于本课题组前期保存细胞株[4]。(2)腺病毒载体：携带hBMP-2和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2/EGFP)、携带EGFP基因的腺病毒对照载体(Ad-EGFP)由Invitrogen公司提供。(3)实验动物：清洁级新西兰大白兔4只，体质量1.50～2.00 kg，购于桂林医学院动物实验中心，实验过程符合动物伦理学要求[5]。(4)主要试剂：胎牛血清购自美国Hyclone公司，低糖DMEM购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、MTT购自韩国Biosharp公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司，4%多聚甲醛、脱钙液由桂林医学院附属医院病理科提供，MTT购自美国Sigma公司。(5)主要仪器：BHC-1300生物安全柜为浙江苏州净化设备有限公司产品，CO2培养箱、-80 ℃超低温冰箱、液氮罐为美国Thermo公司产品，倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品，MLDEL680型酶标仪为美国Bio-Rad公司产品，扫描电镜为FEI Quanta 200 FEG 美国FEI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 制备DBM 将新西兰大白兔处死，取四肢骨及椎体松质骨，根据Urist等[6]方法经-80 ℃低温冻存72 h，剔除骨组织以外组织，脱钙液脱钙72 h，置乙醚、乙醇中各脱脂24 h，以无菌蒸馏水反复冲洗、浸泡，直至浸泡液呈中性为止。此时松质骨块呈白色海绵状,能压缩变形并自动恢复至原状。去酸处理后的骨块继续在蒸馏水中浸泡 24 h,取出后自然晾干，制成4 mm×4 mm×3 mm DBM，环氧乙烷消毒,4 ℃保存备用。

1.2.2 BMSCs的复苏 液氮罐中取出第9代细胞37 ℃水浴锅中解冻，细胞悬液速转移至事先加入DMEM培养基离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加完全培养基重悬，接种于培养皿中，5% CO2、37 ℃饱和湿度环境中培养。贴壁约80%左右传代，取相同代数细胞进入实验。

1.2.3 Ad-BMP-2/EGFP转染兔BMSCs 处于对数生长期第10代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数后按1×106个细胞种植于培养皿中，根据腺病毒携带基因片段不同分为Ad-EGFP与Ad-BMP-2两组。以不含血清的DMEM按病毒滴度稀释病毒原液，使病毒工作液感染复数(multiplicity of infection，MOI)为100感染BMSCs，置培养箱中培养24 h，24 h后换含有15%胎牛血清体积分数的完全培养基继续培养。48 h后荧光显微镜下观察转染Ad-EGFP的BMSCs绿色荧光蛋白的表达，检测转染效率。

1.2.4 免疫组化检测转染后细胞BMP-2的表达 消化Ad-BMP-2转染48 h后的细胞进行爬片、4%多聚甲醛固定，按S-P免疫组化试剂盒进行操作，DAB显色，未转染组设置阴性对照，封片后行倒置显微镜观察。

1.2.5 BMSCs 复合DBM植骨材料 选取脱钙骨基质24块，放入体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液中浸泡12 h，无菌滤纸吸干备用。选取BMP-2基因转染48 h后的BMSCs与同期对照组细胞，胰酶消化后调整细胞密度为1×106个/mL细胞悬液，每块接种0.06 mL，细胞悬液充分渗入后放入37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱中贴附4 h，再缓慢加入体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液静置培养，隔天换液。培养48 h后倒置显微镜、荧光显微镜观察细胞黏附情况

1.2.6 观察细胞在DBM上黏附情况 各组与生物支架材料复合培养6、12、24 h，随机抽取各组4块复合材料，PBS 冲洗3遍,去除未黏附的细胞，0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞并计数,计算细胞黏附率(黏附细胞数/总细胞数×100%)。

1.2.7 扫描电镜观察 材料与细胞复合培养第7天，取各组部分样品，PBS漂洗，2%戊二醛固定，丙酮依次梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金后观察。通过扫描电镜观察材料表面细胞附着、分布、生长情况。

1.2.8 MTT分析DBM植骨材料对转染后BMSCs存活及增殖的影响 实验分为实验组和对照组。实验组为转染BMP-2的BMSCs/DBM复合物，对照组为单纯转染BMP-2的BMSCs，分别于2、4、6、8 d吸出原培养基，加100 μL MTT (5 g/L)，37 ℃孵育4 h后，吸弃孔内上清液，加入二甲基亚砜150 μL，振荡15 min裂解细胞，使沉淀物充分溶解；取出材料后在酶联免疫检测仪上测定吸光度(A)值，测定波长为490 nm。

2 结 果

2.1BMSCs复苏 复苏后的细胞生长状态良好，成梭状生长，旋涡状排列。细胞排列密集，单个细胞轮廓较清楚

2.2Ad-EGFP转染效率的检测Ad-EGFP在MOI=100时转染兔BMSCs48h后，在荧光显微镜观察下，转染后的细胞状态较好，镜下可见绿色荧光表达，肉眼观察转染效率达到95%以上，经Ad-BMP-2转染后BMSCs荧光显微镜下可见绿色荧光，见图1。

2.3 免疫组化检测BMP-2的表达 兔BMSCs转染BMP-2后免疫组化检测结果显示，细胞质中有棕黄色颗粒性染色，呈阳性表达(图2)，而未转染细胞内BMP-2蛋白水平较低，免疫组化结果提示阴性，细胞质无染色。

2.4BMSCs复合DBM植骨材料观察 复合48h后，倒置显微镜下可见DBM材料具有良好孔隙与三维结构(图3)。荧光显微镜下Ad-EGFP转染细胞与DBM复合组可观察到支架材料上细胞正常生长发出明亮绿色荧光，见图4。

2.5 细胞在DBM上黏附率的测定 经细胞计数法检测，细胞与DBM复合6h后，细胞黏附率为(70.00±3.70)%；复合12h后黏附率为(77.00±4.60)%；复合24h后黏附率为(80.00±3.80)%。

2.6 扫描电镜观察 扫描电镜下DBM表面较平整，可见DBM呈现疏松多孔结构，孔径大小不一，形状不规则并相互交通。DBM的孔隙直径为(215.00±86.00)μm，孔隙率达(76.00±3.51)%，见图5。细胞与DBM材料复合体外培养7d后扫描电镜观察可见脱钙骨表面的细胞粘连成片，细胞布满孔隙，呈伸展状、立体状生长，见图6。

图1 显微镜下见Ad-BMP-2 转染后BMSCs(×100)图2 Ad-BMP-2/EGFP转染24h后 BMP-2免疫组化结果(×200)图3 倒置显微镜下见支架 材料细胞(×40)

图4 荧光显微镜下见支架 材料细胞(×100)图5 DBM支架材料三维立体 及孔隙结构(×200)图6 体外复合7d后扫描电镜下 细胞(×600)

2.7MTT分析DBM对BMSCs存活及增殖的影响 实验组与对照组的A值，都随时间延长而逐渐增高，经检测于2、4、6、8d各组之间吸光度值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1

表1 两组细胞MTT A值比较

3 讨 论

组织工程骨构建分为3个主要方面：种子细胞、细胞因子、支架材料。支架材料作为一个重要方面不仅影响细胞黏附后的生物学效应，而且决定组织工程骨植入体内后是否能与机体相结合并且进行修复作用。理想组织工程骨需要具有以下几个方面[7-8]：(1)生物相容性。支架材料表面是否适于细胞黏附、生长、增殖与分泌骨基质，最好还应具备骨传导性与骨诱导性双重特性[9-10]。支架材料在满足医用生物材料基本要求之外，材料植入体内后支架材料本身与其降解产物不会产生炎性反应、免疫反应与毒副作用。(2)物理性质。支架材料需要具有易于塑形，方便加工与操作，便于进一步应用。材料需要具备良好的三维立体孔隙结构，提供细胞生长、血管与神经长入的空间，同时便于代谢产物的排出。(3)降解性。生物支架材料应具备完全自我降解能力，为新生组织结构提供足够空间有利于自身骨组织重建。

BMP是一类能够在体内外都有强烈的诱导启动成骨分化的作用,其作用贯穿整个成骨过程。其中BMP-2以其突出的骨诱导活性[11-13],已被广泛应用于骨组织工程领域。本实验同时以腺病毒为载体介导h-BMP2、EGFP基因体外转染兔BMSCs，通过观察发现转染后细胞生长情况正常，腺病毒转染效率大于95%。EGFP基因表达的EGFP蛋白，可在荧光显微镜下发绿色荧光，作为报告蛋白，间接反映EGFP/BMP-2基因成功进入细胞并表达相应目的蛋白[14]。经Ad-hBMP-2转染后，转染后兔BMSCs细胞rh-BMP-2免疫组化结果呈阳性表达，提示兔BMSCs能够表达目的基因，利用腺病毒重组BMP2基因可以成功进行基因转移并且保持外源性基因在细胞内部的表达，通过过表达目的蛋白，促进BMSCs向成骨细胞分化，加快骨组织生成。

现阶段研究使用的组织工程骨主要由生物材料与人工合成材料组成。人工合成材料植入体内后易出现排斥与炎性反应，并且人工合成材料不具备促进细胞增殖与分化的特点[15]，导致实验结果无法达到预期水平。本实验参照Urist等[6]方法制得同种异体DBM，经过检测后显示制备的DBM具有良好的三维立体与孔隙结构，其平均孔隙率约为(76.00±3.51)%，孔径大小为(215.00±86.00)μm。以上数据说明制备DBM内部具有相互连通的空隙与足够空间从而有利于细胞在支架内部生长、增殖、血管神经长入、代谢及降解产物的排出。支架材料体外复合细胞培养能够简单、快速、便捷观察细胞与支架材料的生物相容性。本实验将经腺病毒转染EGFP后的细胞种植到DBM支架材料后继续置于完全培养基中培养，通过荧光显微镜下可见细胞生长状况良好，细胞黏附于支架材料上发出明亮绿色荧光。扫描电镜观察腺病毒转染hBMP-2后的细胞良好的贴附与于支架材料表面。细胞生长状态良好，伸出伪足至DBM孔隙中，细胞相互重叠紧密附着在周围的孔隙结构中。

本实验利用MTT法观察BMSCs的增殖情况，结果表明各组之间细胞生长与增殖情况良好，无明显差异，证明同种异体DBM支架材料对于细胞的生长、增殖无影响，说明同种异体DBM支架材料具备理想的生物相容性。

本实验运用腺病毒为载体重组hBMP-2转染BMSCs后种植同种异体DBM支架材料上，通过上述一系列观察证实种植于支架材料上的细胞生长情况良好，能够稳定吸附支架上，构建成稳定的组织工程骨，从而为进一步修复骨缺损动物模型奠定了基础。

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Study on biocompatibility of Ad-rhBMP-2 transfection on rabbit BMSCs combined with allogeneic DBM*

CaiWeiliang,LiQiang△,NingYinkuan,WuChengcong,ChenJiabin,ShiZhengsong

(SecondDepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541000,China)

Objective To observe the biocompatibility of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with allogeneic decalcified bone matrix(DBM) after transfecting adenoviral recombinant human bone morphogenetic protein-2(Ad-rhBMP-2).Methods The rabbit allogeneic DBM material was prepared according to the Ursit method.After transfecting Ad-BMP-2 on rabbit bone marrow mesenchymal stem cells,the immunohistochemical was used to detect the expression of BMP-2 in the transfected cells;after 48 h of transfection,the cells were planted on the allograft DBM,then the scanning electron microscopy was used to observe the cell growth and adhesion condition on material,and the proliferation condition of BMSCs was detected by MTT.Results After 48 h of adenoviral transfection,BMSCs could express BMP-2 successfully.The scanning electron microscopy showed that the cells after transfection adhered well and massively proliferated on DBM material.The MTT assay showed that the proliferation condition of the cells after transfection planted on DBM was normal,which showed no statistically significant difference when compared with the control group (P>0.05).Conclusion The Ad-BMP-2 transfection on BMSCs is well biocompatible to allogeneic DBM.

bone morphogenetic proteins;adenoviridae;bone marrow;mesenchymal stem cells;decalcified bone matrix

� 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.001

国家自然科学基金资助项目(31160199)。 作者简介：蔡伟良(1988-)，在读硕士研究生，主要从事骨组织工程研究。△

，Tel:15977330608；E-mail:li.q12251970 @163.com。

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A

1671-8348(2015)10-1297-03

2014-10-20

2014-12-10)