大鼠脑缺血再灌注损伤过程中TRAF6的表达变化*

袁 平，何晓英，李小刚

(泸州医学院附属医院神经内科，四川泸州 646000)



大鼠脑缺血再灌注损伤过程中TRAF6的表达变化*

袁 平，何晓英，李小刚

(泸州医学院附属医院神经内科，四川泸州 646000)

目的 观察肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法 将40只成年健康SD大鼠按照随机对照的原则，分成5组，每组8只：假手术组，缺血组，缺血再灌注2 h组 (R2 h组)，缺血再灌注12 h组(R12 h组)，缺血再灌注24 h组(R24 h组)。构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型，RT-PCR和Western blot检测TRAF6的表达变化。免疫组化检测定位TRAF6蛋白。结果 与假手术组比较，缺血组和R2 h组、R12 h组、R24 h组TRAF6表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。TRAF6主要定位于神经元细胞细胞质。结论 大脑遭受缺血再灌注损伤时，活化的TRAF6参与脑细胞死亡。

肿瘤坏死因子受体相关肽和相关蛋白质类；脑缺血；再灌注损伤；细胞死亡

缺血性脑卒中仍旧是全球主要致死和致残的疾病之一，其病理、生理特点是脑血管的缺血以及再灌注，伴随血流的减少以及再灌注时自由基等的生成，最终导致脑细胞的损伤以及死亡[1]。有研究发现，Toll样受体信号通路介导的炎症免疫反应参与脑缺血再灌注损伤过程，但具体的分子机制不清楚[2]。本研究通过构建大鼠脑缺血再灌注损伤(ischemic-reperfusion injury，I/R)模型，检测Toll样受体下游关键接头蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor-associated 6，TRAF6)的表达变化，旨在探讨脑I/R的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 成年健康SD大鼠40只，体质量220～260 g,购于泸州医学院实验动物中心。2,3,5-triphenyletetrazolium chloride (TTC)染色试剂购自美国Sigma公司，Trizol试剂盒购自Invitrogen 公司，Reagents试剂盒购自宝生物工程公司，荧光定量仪iCycler iQ购自美国Bio-Rad公司，蛋白定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。一抗购自美国Upstate公司，二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将40只成年健康SD大鼠按照随机对照的原则，分成假手术组、缺血组、缺血再灌注2 h组(R2 h组)，缺血再灌注12 h组(R12 h组)，缺血再灌注24 h组(R24 h组)，每组8只。

1.2.2 建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)动物模型 应用Zea Longa 线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立大鼠大脑中动脉I/R模型，在脑缺血1 h后，抽去线恢复血流灌注，分别于再灌注2、12、24 h处死动物，取脑组织和外周血备用[3]。

1.2.3 TTC染色和脑梗死面积的计算 脑组织切片，TTC染色，37 ℃ 20 min，梗死区变白色，非梗死区变红色。计算梗死面积，为校正脑水肿带来梗死体积的偏差，梗死体积以所占大脑半球的百分率来表示，梗死体积百分比=脑梗死体积/对侧正常脑组织体积×100%。

1.2.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测TRAF6 mRNA表达 每只大鼠取下约50 mg脑组织，在Trizol中提取总RNA按照说明书进行，cDNA合成按Reagents试剂盒说明书。引物、荧光探针由中国大连TaKaRa公司合成，TRAF6上游引物：5′-TCT GCT TGA TGG CTT TAC G-3′，下游引物：5′-ACC GTC AGG GAA AGA ATC T-3′，探针序列：5′-FAM-AGC AGT GCA AAC ACC ATG TGG C-ECLIPSE-3′，片段长度为181 bp；β-actin上游引物：5′-CGT GAA AAG ATG ACC CAG AT-3′，下游引物：5′-ACC CTC ATA GAT GGG CAC A-3′，探针序列：5′-FAM-TCA ACA CCC CAG CCA TGT ACG T-TAMRA-3′，片段长度为158 bp。RT-PCR检测：30 μL反应体系，PCR反应为94 ℃ 变性3 min；51 ℃(TRAF6)退火20 s；72 ℃延伸30 s，共40个循环，β-actin作为内参照基因，所有反应均在荧光定量仪iCycler iQ上进行。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶进行电泳。

1.2.5 Western blot检测TRAF6蛋白表达 取100 g脑组织进行匀浆，4 ℃下离心5 min，取上清液。用蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，根据各样品蛋白浓度计算上样体积进行上样，经分离、电泳等将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，用丽春红染色，蒸馏水冲洗，以含脱脂奶粉的1×三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水吐温(TBST)溶液封闭，TBST洗涤。加入一抗，孵育，TBST冲洗，加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育，再冲洗，加入化学发光剂显影。将硝酸纤维素膜用图像分析仪分析，以相应蛋白条带面积的平均灰度值来表示TRAF6活化水平的相对水平。

1.2.6 免疫组化(IHC) 定位TRAF6蛋白 常规石蜡切片，二甲苯脱蜡2次；乙醇浸泡，PBS冲洗。滴加50 μL山羊血清封闭液，37 ℃孵育30 min。甩去封闭血清，按1∶25滴加羊抗鼠TRAF6单克隆抗体，4 ℃冰箱过夜。PBS冲洗。滴加50 μL生物素标记兔抗羊IgG(二抗)，37 ℃孵箱孵育。PBS冲洗3次。滴加50 μL辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃孵箱孵育。PBS冲洗。DAB显色后，及时终止显色。苏木素复染，自来水冲洗，酸乙醇分色。将所有切片分批在80%、90%、95%、100%乙醇中脱水，二甲苯透明，加拿大树胶封片。高倍显微镜下观察，细胞膜或细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达。

2 结 果

2.1 脑梗死面积 在缺血组和R2组、R12h组、R24h组都发现脑梗死，而假手术组未发现脑梗死。计算脑梗死面积发现，缺血组梗死最严重，再灌注组随着时间推移，梗死程度逐渐减轻，见图1。

A：TTC染色结果；B：脑梗死面积柱状图；a：P<0.05与假手术组比较；b：P<0.05，与缺血组比较。

图1 各组大鼠脑组织梗死面积比较

2.2 各组大鼠脑组织TRAF6 表达比较 与假手术组比较，缺血组、R2h组、R12h组脑组织TRAF6mRNA明显升高(P<0.05)。Westernblot检测也证实，TRAF6蛋白水平在缺血组、R2h组、R12h组明显升高，见图2、3。

2.3IHC定位TRAF6蛋白 与RT-PCR、Westernblot检测结果相似，在假手术组脑组织中，TRAF6蛋白呈低表达，在缺血组以及各再灌注组，TRAF6表达明显升高。且TRAF6蛋白主要分布在神经元细胞细胞质，部分分布在血管内皮细胞。与假手术组比较，缺血组和各再灌注组阳性细胞率明显升高，其中缺血组最高，R2组、R12h组逐渐减低，而R24h组又再度升高，见图4、5。

a：P<0.05与假手术组比较。

图2 各组大鼠脑组织TRAF6基因表达比较

图3 Western blot检测各组脑组织TRAF6蛋白表达

图4 IHC检测各组脑组织TRAF6蛋白表达

图5 各组TRAF6阳性细胞率比较

3 讨 论

临床上，脑梗死及溶栓后血管再通所引起的I/R是加剧脑损伤及功能障碍的主要原因[4]。Toll样受体介导的炎症免疫在脑I/R过程中的作用日益受到重视[5-6]，本研究通过观察其下游接头分子TRAF6表达变化，以探讨TRAF6在大鼠脑缺血和再灌注过程中的作用。

本研究采用经典的大鼠脑I/R模型，缺血组和各再灌注组大鼠脑组织都有不同程度梗死灶存在，证实建立模型成功，且梗死的面积随着再灌注的恢复逐渐减少。从基因水平和蛋白水平分别检测TRAF6表达，结果发现，无论缺血还是再灌注早期(12h)，TRAF6表达均明显升高，表明TRAF6参与了大鼠脑I/R病理、生理过程。TRAF6在大脑遭受缺血和再灌注打击时，明显激活，其变化趋势与大脑梗死面积变化相似，表明TRAF6参与介导了大脑细胞的死亡信号。

TRAF6是肿瘤坏死因子受体 (TNFR) 家族重要的成员，其不但能介导TNFR家族信号，还能介导TLR家族信号[7-8]。所以，TRAF6可能通过介导不同信号通路，调控炎症免疫和凋亡效应。TRAF6的缺失将导致信号的缺失，NF-κB去激活以及下游细胞因子的减少[9-10]。有研究证实，TRAF6可能广泛参与各种细胞的死亡，尤其是细胞凋亡[11-12]。Liu等[13]证实TRAF6可以通过Caspase-8依赖的方式介导细胞死亡。在LPS诱导的兔肾小管细胞，通过抑制TRAF6表达可以抑制肾炎性反应，其机制为抑制Caspase-3活化，证实TRAF6通过介导Caspase-3信号参与细胞凋亡[14]。有研究还证实，TRAF6通过介导细胞凋亡参与了中枢神经系统的发育过程[15]。本研究认为，在大脑遭受缺血和再灌注损伤以后，TRAF6可能通过介导细胞凋亡信号来参与调控脑细胞死亡，但具体的机制还有待进一步的探讨。

免疫组化用来定位TRAF6在脑组织中的表达，结果与RT-PCR、Westernblot检测结果相似，在缺血期和再灌注期，TRAF6表达明显升高的。着色强的TRAF6主要位于神经元细胞细胞质，较弱的TRAF6着色在脑血管内皮细胞被发现。因此，本研究推测在TRAF6介导脑细胞死亡过程中，神经元细胞是主要的靶细胞。

本研究结果表明，在大鼠脑I/R过程中，TRAF6可能参与了调节脑损伤的炎症过程，可能的机制是介导脑细胞的死亡信号。进一步的研究需要证实TRAF6与脑细胞凋亡的相互作用机制。

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Change of TRAF6 expression in rat cerebral ischemia reperfusion injury*

YuanPing,HeXiaoying,LiXiaogang

(DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To investigate the potential role of tumor necrosis factor receptor-associated factor-6(TRAF6) in the rat cerebral ischema- reperfusion injury.Methods 40 healthy adult SD rats were divided into 5 groups(n=8) according to the random control principle:sham operation group,ischemia group,reperfusion 2 h group(R2 h),reperfusion 12 h group(R12 h) and reperfusion 24 h group(R24 h).The rat cerebral ischemia -reperfusion injury model was constructed.The change of TRAF6 expression was examined by RT-PCR and Western-blot.Then,the immunohistochemistry was adopted to locate the TRAF6 protein.Results Compared with the sham group,the expression of TRAF6 in the ischemia group and the R2 h,R12 h and R 24 h groups was obviously increased,but the difference had no statistical significance (P<0.05).TRAF6 was mainly located in the cytoplasm of neuronal cells.Conclusion Activated TRAF6 is involved in the brain cell death induced by cerebral ischemia-reperfusion.

tumor necrosis factor receptor-associated peptides and related proteins;brain ischemia;reperfusion injury;cell death

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.006

四川省卫生厅课题资助项目(100272)。 作者简介：袁平(1978-)，主治医师，主要从事缺血性脑血管疾病的诊治研究。

R743.33

A

1671-8348(2015)10-1314-03

2014-10-18

2014-12-15)