RAGE/NF-κB信号通路调控溶血卵磷脂诱导的人视网膜内皮细胞TGF-β1表达*

喻日成，罗建华，范元硕，刘 波

(贵州省人民医院内分泌科，贵州贵阳 55000)



RAGE/NF-κB信号通路调控溶血卵磷脂诱导的人视网膜内皮细胞TGF-β1表达*

喻日成，罗建华△，范元硕，刘 波

(贵州省人民医院内分泌科，贵州贵阳 55000)

目的 探讨糖基化终产物受体(RAGE)/核因子κB(NF-κB)信号通路在调控溶血卵磷脂(LPC)诱导的人视网膜内皮细胞(HERCs)转化生长因子β1(TGF-β1)表达中的作用。方法 利用RAGEsiRNA及NF-κB抑制剂作用RAGE/NF-κB信号通路，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及Westernblot检测RAGE及TGF-β1基因表达。结果LPC能增加HERCs的RAGE、TGF-β1基因表达，RAGE基因沉默后能抑制LPC诱导的RAGE、TGF-β1的表达。加入NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)能显著减少LPC诱导的RAGE、TGF-β1基因表达。结论RAGE/NF-κB信号通路在调控LPC诱导的HERCs表达TGF-β1中起重要作用。

溶血磷脂酰胆碱类；糖基化终产物受体；人视网膜内皮细胞；转化生长因子β1

糖尿病视网膜病变是视网膜微血管的一种进行性病变，主要表现为毛细血管通透性增加、管腔闭塞、新生血管形成[1]。晚期糖基化终产物(advanced glycation endproducts，AGEs)及AGE受体(receptor for AGE，RAGE)的相互作用在糖尿病血管并发症中发挥重要作用[2]。AGEs通过RAGE激活核因子κB(NF-κB)及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，而NF-κB的激活能增加视网膜微血管氧化应激及多种细胞因子[如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)]的释放，参与糖尿病视网膜病变的发生、发展[3]。溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine，LPC)是氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)的主要成分，与人类多种疾病如动脉粥样硬化、糖尿病及恶性肿瘤密切相关[4]。目前LPC在糖尿病视网膜微血管病变中的作用机制还不清楚，本研究通过RNA干扰及NF-κB抑制剂，探讨RAGE/NF-κB信号通路在调控人视网膜内皮细胞(human retinal endothelial cells，HRECs)分泌TGF-β1中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂：LPC购自Sigma公司；低糖改良Eagle培养基(DMEM)培基及胎牛血清购自Giboco公司；HRECs购自ScienCell公司；逆转录试剂盒购自Biosystems公司；RAGE抗体购自BD Biosciences公司；TGF-β1、β-actin抗体及辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗购自Santa Cruz公司；HiPerFect转染试剂盒购自QIAGEN公司；LightCycler®TaqMan®Master购自Roche公司；NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)购自Sigma公司；

1.2 方法

1.2.1 RAGE-siRNA转染细胞 HRECs在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养液中37 ℃、5%CO2培养。在转染细胞前，HRECs种植在6孔板中，每孔细胞数约2.5×105个，待细胞生长至80%左右开始转染实验。在6孔板的每孔中加入300 ng的RAGE siRNA稀释于100 μL无血清培养基中，再加入18 μL HiPerFect转染试剂室温下共同孵育10 min，将转染混合物加入到含有700 μL无血清培养基37 ℃培养3 h之后，加入1 600 μL含有10%FBS的完全培养基培养48 h。

1.2.2 实验分组 (1)RAGE siRNA作用HRECs：分为对照siRNA组、LPC+RAGE siRNA组、LPC+对照siRNA组、RAGE siRNA组，LPC 的浓度为40 μmol。(2)PDTC作用HRECs：分为对照组、LPC组、LPC+PDTC组，LPC 的浓度为40 μmol。

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RAGE、TGF-β1mRNA表达 RT-qPCR检测以GAPDH为内参照，按Trizol试剂盒说明书介绍的方法提取总RNA，采用Nanodrop ND1000 测量RNA水平。按逆转录试剂盒说明合成cDNA，总反应体系20 μL，反应条件：25 ℃10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，冷却至4 ℃后取出-20 ℃保存。PCR扩增：cDNA模板2 μL，TaqMan®Master 5 μL，双蒸水(ddH2O)2.5 μL，引物0.5 μL。RAGE上游引物:5′-AGC TTC AGT CTG GGC CTT C-3′,下游引物:5′-CAG CTG AAT GCC CTC TGG-3′;TGF-β1上游引物:5′-TGA ACC AAG GAG ACG GAA TAC AGG-3,下游引物:5′-GCC ATG AGG AGC AGG AAG GG-3′;GAPDH上游引物:5′-CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC-3′,下游引物:5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3′。PCR 反应条件：95 ℃10 min(1个循环)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s (45个循环)，72 ℃ 5 min(1 循环)。每个qPCR重复3次，目的基因mRNA的相对表达量通过公式2-△△Ct计算。

1.2.4 Western blot检测RAGE、TGF-β1蛋白表达水平 Western blot检测以β-actin为内参照。收集处理的细胞，用冰磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗3次，加入细胞裂解液，提取总蛋白，通过二辛可宁酸(BCA)方法测量蛋白水平。将30 μg的蛋白样品加入10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)点样孔，100 V电压电泳2 h。转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%的脱脂牛奶封闭，分别加RAGE、TGF-β1、β-actin一抗4 ℃过夜，Tris缓冲生理盐水吐温(TBST)洗3次，HRP标记的二抗常温下30 min，TBST洗3次。化学发光法显影、定影，将胶片进行扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

2 结 果

2.1RAGEsiRNA下调RAGE、TGF-β1基因表达HRECs转染RAGEsiRNA和对照siRNA后通过RT-qPCR及Westernblot检测RAGE、TGF-β1基因的表达，与对照siRNA组比较，LPC+对照siRNA组RAGE及TGF-β1基因表达明显上调(P<0.05)，RAGEsiRNA组RAGE及TGF-β1基因表达明显下调(P<0.05)；LPC+对照siRNA组与LPC+RAGEsiRNA组比较，RAGE及TGF-β1基因表达明显下调(P<0.05)，见图1。

1：LPC+RAGEsiRNA组；2：LPC+对照siRNA组；3：RAGEsiRNA组；4：对照siRNA组；a：P<0.05，与LPC+对照siRNA组比较；b：P<0.05，与对照siRNA组比较。

图1RAGEsiRNA对HRECsTGF-β1、

RAGE基因表达的影响

2.2PDTC下调RAGE、TGF-β1基因表达HRECs加入PDTC后通过RT-qPCR及WesternBlot检测RAGE、TGF-β1基因的表达，结果显示：LPC作用HRECs后RAGE、TGF-β1基因表达明显上调(P<0.05)；与LPC组比较，LPC+PDTC组RAGE、TGF-β1基因表达出现明显下调(P<0.05)，见图2。

1：LPC+PDTC组；2：LPC组；3：对照组；a：P<0.05，与LPC+PDTC组比较。

图2PDTC对HRECsTGF-β1、RAGE基因表达的影响

3 讨 论

Ox-LDL中的主要成分LPC与多种疾病如动脉粥样硬化、糖尿病慢性并发症、哮喘等关系密切[4-5]。Ox-LDL所致血管内皮细胞功能紊乱是糖尿病慢些并发症发病机制的关键环节之一[6]。LPC作为Ox-LDL中一种促炎症颗粒能启动细胞内一系列的信号传导通路，与慢性低度炎症性疾病密切相关[7]。LPC能促进内皮细胞表达黏附分子，使白细胞浸润至内皮细胞下，启动血管的炎症反应[8]。Yu等[9]研究表明，Ox-LDL导致的内皮细胞的炎症反应与高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox1，HMGB1)的释放有关。HMGB1与RAGE结合激活NF-κB，上调炎症分子的表达。Ox-LDL/HMGB1-RAGE/NF-κB组成的信号通路在血管内皮细胞的慢些炎症中起重要作用[10]。糖尿病视网膜病变是糖尿病的一种常见慢性并发症，视网膜内皮细胞功能紊乱在其中起重要作用。脂质能不依赖高血糖导致血管的损伤，特别是Ox-LDL能通过增加细胞因子的产生刺激炎症反应及纤维形成[11]。

本研究表明，LPC作用于HRECs后，RAGE及TGF-β1的表达明显上调。RAGE是一种能与多种配体结合的受体，如AGEs、HMGB1，RAGE与配体结合后可激活NF-κB通路，上调一系列的血管活性因子的表达[12]。而血管活性因子TGF-β1的升高与糖尿病微血管慢性并发症密切相关[13]。因此，本研究推测LPC作用HRECs所致的TGF-β1上调与RAGE的表达上调有关。为了证实其推测，本研究采用RNA干扰技术沉默RAGE基因，结果发现RAGE基因沉默后，LPC诱导的TGF-β1的表达明显下调，本实验结果表明，LPC诱导的HRECs表达TGF-β1的上调部分是通过RAGE起作用。

RAGE与配体结合后激活NF-κB，活化的NF-κB作为一种正反馈，又可进一步促进RAGE与配体结合，二者构成级联反应造成细胞内环境的改变和损伤，促进细胞因子和组织因子的释放[14]。RAGE通过NF-κB途径促进氧化应激及促炎因子的释放加重血管内皮细胞的损害[15]。为了阐明NF-κB对LPC诱导的HRECs表达TGF-β1及RAGE的影响，本研究用NF-κB抑制剂PDTC作用细胞，实验结果表明，加入PDTC后，HRECs表达RAGE及TGF-β1明显下降。本实验结果提示，NF-κB参与了LPC诱导的视网膜微血管内皮细胞TGF-β1的表达调控。

本研究结果表明，RAGE/NF-κB信号通路在调控LPC诱导的HRECs表达TGF-β1中起重要作用。RAGE与NF-κB相互作用产生的级联反应参与了脂代谢紊乱所致的糖尿病视网膜病变。

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RAGE/NF-κB signal pathway in mediating lysophosphatidylcholine-induced TGF-β1expression in human retinal endothelial cells*

YuRicheng,LuoJianhua△,FanYuanshuo,LiuBo

(DepartmentofEndocrinology,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou55000,China)

Objective To investigate the role of receptor for advanced glycation end products (RAGE)/NF-κB signaling pathway in mediating lysophosphatidylcholine (LPC)-induced TGF-β1expression in human retinal endothelial progenitor cells(HEPCs).Methods Human retinal endothelial cells (HERCs) were transfected with siRNA for RAGE siRNA or added NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) in the presence or absence of LPC,the expressions of TGF-β1and RAGE genes were analyzed by qPCR and Western blot.Results LPC could increase the expression of RAGE and TGF-β1gene in HERCs.The RAGE gene after silence could significantly decrease the expression of LPC-induced RAGE and TGF-β1.Adding NF-κB inhibitor PDTC significantly reduced LPC-induced RAGE and TGF-β1expression in HERCs.Conclusion RAGE/NF-κB signaling pathway plays an important role in mediating LPC induced TGF-β1gene expression in HERCs.

lysophosphatidylcholines;receptor for advanced glycation end products;human retinal endothelial cells;transforming growth factor beta1

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.008

贵州省科学技术基金资助项目[黔科合J字(2009)2]。 作者简介：喻日成(1976-)，主治医师，博士研究生，主要从事糖尿病慢性并发症研究。△

，E-mail：luojianhua_gy@163.com。

R

A

1671-8348(2015)10-1319-03

2014-10-20

2014-12-20)