MMP-14蛋白在胃癌侵袭转移中的表达和作用

谷倬宇，李思源，肖智伟，周 婷，李 军△

(1.石河子大学医学院第一附属医院；2.新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆石河子 832002)



MMP-14蛋白在胃癌侵袭转移中的表达和作用

谷倬宇1，李思源2，肖智伟1，周 婷1，李 军1△

(1.石河子大学医学院第一附属医院；2.新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆石河子 832002)

目的 探讨人胃癌组织中基质金属蛋白酶14(MMP-14)的表达及其与胃癌侵袭、转移的关系。方法 采用免疫组化法检测59份胃癌组织(观察组)和20份正常胃组织(对照组，为经病理证实距肿块边缘5cm的正常组织)中MMP-14的表达情况，并分析MMP-14与胃癌临床病理参数的关系，以及MMP-14在胃癌不同TNM分期中的表达特点。结果 观察组胃癌组织中MMP-14的表达阳性率为50.85% (30/59)，对照组胃组织MMP-14表达阳性率为5.00% (1/20)，观察组MMP-14表达阳性率明显高于对照组(P<0.01)；MMP-14的表达水平与胃癌分化程度、区域淋巴结转移程度、浸润深度、淋巴管浸润与否及TNM分期有关，均差异有统计学意义(P<0.01)；随着TNM分期的进展MMP-14蛋白表达上调，且有从细胞质向细胞膜转运的趋势。结论 胃癌组织中存在MMP-14的高表达，有助于胃癌细胞的侵袭和转移。

胃肿瘤；基质金属蛋白酶14；肿瘤浸润；肿瘤转移；免疫组织化学

胃癌是中国乃至世界上最常见的致死性恶性肿瘤之一，其恶性程度分别排在中国男性和女性的第3位和第4位[1-2]。胃癌患者的病死率极高，死因多是由于原发灶的术后转移复发和周围血管浸润，其发病机制十分复杂，研究证实溶解周围基质是该过程的关键生物学事件，而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)可降解细胞基底膜(BD)和细胞外基质(ECM)，是该过程中最重要的蛋白水解酶类，是肿瘤细胞向周围浸润的重要桥梁[3]。MMPs中跨膜的MMP-14蛋白，是恶性肿瘤入侵的关键蛋白[4-5]。本试验通过测定胃癌组织和正常胃组织中MMP-14的蛋白表达情况，分析MMP-14与胃癌临床病理特征的关系，并探讨其在不同胃癌组织TNM分期中的表达特点，旨在探讨胃癌侵袭转移的相关机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取石河子大学医学院第一附属医院病理科2012年1月至2013年5月经10%甲醛固定和石蜡包埋的胃癌组织切片59份(观察组)，经病理专家验证距肿瘤边缘5 cm的正常胃组织20份(对照组)。观察组中男44例，女15例；年龄50～81岁，平均(60.41±7.21)岁。纳入标准：符合WHO胃癌诊断标准；术前未行分子靶向治疗、生物基因治疗及放化疗；由至少两位病理专家共同阅片确诊；临床资料完整。

1.2 方法

1.2.1 抗体和试剂 MMP-14兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司，免疫组化染色试剂盒SP9000及浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2.2 免疫组化染色 4 μm的石蜡切片脱蜡水化后用新鲜配制的3%过氧化氢液体进行室温封闭，PBS清洗干净后滴加正常山羊血清封闭液室温封闭30 min，4 ℃滴加1∶100稀释比例的一抗过夜，37 ℃复温1 h后滴加生物素化二抗孵育半小时，依染色试剂盒说明书室温滴加辣根过氧化物酶标记工作液，镜下DAB显色，苏木素复染脱水后用中性透明树胶封片。以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判定 染色结果判定采用半定量分析法，在高倍镜下随机挑选5个视野，根据细胞染色强度计分：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据阳性细胞百分率计分：<5%为0分，5%～<25%为1分，25%～<50%为2分，50%～<75%为3分，≥75%为4分。两项评分相乘：0～1分为阴性，>1分为阳性。

1.2.4 免疫组化图像分析 随机选取TNM分期中10个不同的视野，采用Image Pro Plus 6.0图像检测系统分析细胞染色结果，用平均光密度(OD)值表示MMP-14染色强度。

1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS18.0统计软件进行分析，采用χ2检验分析MMP-14与临床病理特征的关系，采用方差分析和LSD检验分析不同TNM分期的OD值。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MMP-14在胃癌组织和正常胃组织中的表达 MMP-14在正常胃组织中阴性表达(图1A)，仅有极少数微弱表达。MMP-14在胃癌组织中的表达主要位于细胞质，大多数呈中等或强阳性表达(图1B)。观察组MMP-14阳性表达率为50.85%(30/59)，显著高于对照组5.00%(1/20)，两组比较差异有统计学意义(χ2=11.32，P<0.01)。

图1 对照组(A)及胃癌组(B)MMP-14的免疫组化染色结果(×100)

2.2 MMP-14表达与胃癌临床病理特征的关系 胃癌浸润程度越深、分化程度越低、淋巴结转移程度越重、TNM分期进展程度越晚，MMP-14表达的阳性率越高(P<0.01)，见表1。

2.3 MMP-14表达在胃癌不同TNM分期中的表达特点 MMP-14在胃癌细胞中的表达多位于细胞质，随着TNM分期进展，开始出现细胞膜表达(图2，箭头为细胞膜阳性)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的平均OD值分别为222.64±6.73、250.22±11.41、295.63±6.88，不同TNM分期的MMP-14表达强度差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

图2 MMP-14在细胞膜阳性表达(×400)

临床病理特征nMMP-14阳性χ2P分化程度 高、中22(37.29)4(18.18)12.970.00 低37(62.71)26(70.27)浸润深度 T1～220(33.90)5(25.00)8.090.00 T3～439(66.10)25(64.10)

续表1 MMP-14表达与胃癌临床病理特征的关系[n(%)]

a：P<0.01，与Ⅱ期比较;b：P<0.01，与Ⅲ期比较。

图3 MMP-14在不同TNM分期中的平均OD值比较

3 讨 论

MMPs通过对ECM中各种成分的降解，在肿瘤侵袭转移中的作用十分关键，是一组重要的ECM降解酶类。大量研究表明，MMPs的高表达和多种肿瘤的发生、发展密切相关[6-8]。MMP-14是MMPs家族的重要成员，又被称为膜型MMP-1(MT1-MMP)，是第1个发现的具有跨膜序列的MMPs，MMPs的表达增加可以触发级联激活过程，致使细胞周围的纤维蛋白溶解，这是肿瘤细胞侵袭的重要特征[9]。

国内研究发现，MMP-14在胃癌组织中阳性表达率很高，并且MMP-14阳性表达组与阴性对照组相比更易发生区域淋巴结转移[10]。国外研究显示，胃癌组织和癌旁正常组织中MMP-14 蛋白表达的比值与淋巴转移和肿瘤分期有关[11]，胃癌细胞中MMP-14表达下调后发生转移的能力下降，增殖能力强、侵袭迁移能力高的肿瘤细胞MMP-14的表达明显上调[12-13]。本研究胃癌组织中MMP-14蛋白表达阳性率为50.85%，与文献报道接近[10]。本研究结果也证明了胃癌组织中MMP-14的阳性表达与胃癌的区域淋巴结转移程度、浸润深度、TNM分期等密切相关，提示MMP-14在肿瘤的浸润、转移中起着举足轻重的作用。近年来的研究发现上调非经典Wnt通路中Wnt5a的表达，可使聚集增多的β-catenin与核内转录因子发生作用，进而激活靶基因诱导MMP-14表达[14-15]。此外NF-κB通路介导的环氧合酶-2的表达也可能是MMP-14的一个重要调控点[16]，而MMP-14表达相关的分子机制仍有待于进一步的研究。

在侵袭转移过程中，随着肿瘤细胞与ECM相互作用并对其进行重塑，MMP-14开始在细胞膜伪足处聚集，这种伪足是特殊的细胞膜突起，富含支架蛋白、肌动蛋白、胞吐复合体及各种酶类，是肿瘤入侵的首要区域[17]。本研究结果表明，随着TNM分期进展，MMP-14蛋白表达上调并开始出现细胞膜阳性，这不仅提示胃癌细胞的侵袭能力与MMP-14表达水平呈正相关，而且提示细胞内存在某种运动调控机制使MMP-14逐渐向细胞膜定向转运，进而有助于胃癌细胞侵袭和转移，但具体的胞内转运机制尚不明确。

综上所述，胃癌组织中的MMP-14表达水平明显增高，且胃癌侵袭转移的关键事件可能是通过影响MMP-14的表达和转运而增加胃癌的侵袭力，目前的研究结果提示，可以通过抑制MMP-14的作用进而影响肿瘤的侵袭和转移能力。因此，对MMP-14的深入研究将有助于对肿瘤治疗提供新的治疗前景，为临床进一步治疗晚期恶性肿瘤提供新的思路。

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Expression and role of MMP-14 protein in invasion and metastasis of stomach carcinoma

GuZhuoyu1,LiSiyuan2,XiaoZhiwei1,ZhouTing1,LiJun1△

(1.FirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832002,China;2.KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseaseofMinistryofEducation,Shihezi,Xinjiang832002,China)

Objective To explore the expression of matrix metalloproteinase-14(MMP-14) protein in the human stomach carcinoma tissues and its correlation with carcinoma invasiveness and metastasis.Methods The MMP-14 protein expression was detected by immunohistochemistry in 59 cases of stomach carcinoma tissues (observation group) and 20 cases of normal stomach tissues (control group,the adjacent normal tissues from the tumor margin of 5 cm confirmed by pathology),and its correlation with the clinically pathological parameters was analyzed.The expression characteristics of MMP-14 among various TNM stages of stomach carcinoma were also analyzed.Results The positive rate of MMP-14 expression was 50.85%(30/59) in the observation group and 5.00% (1/20) in the control group,the positive rate of the observation group was significantly higher than that of the control group (P<0.01);the expression level of MMP-14 was correlated with the differentiation degree,regional lymph node metastasis degree,invasion depth,lymphatic invasion and TNM stage,which showing the statistical difference(P<0.01);the expression of MMP-14 protein was up-regulated and showed the transferring trend from cytoplasm to cellular membrane along with the progression of TNM stage.Conclusion The overexpression of MMP-14 protein exists in stomach carcinoma tissues,which contributing to the invasion and metastasis of stomach carcinoma cells.

stomach neoplasms;matrix metalloproteinase 14;neoplasm invasiveness;neoplasm metastasis;immunohistochemistry

谷倬宇(1989-)，在读硕士研究生，主要从事消化系统肿瘤的诊治研究。△

,Tel:18703093580;E-mail：xjlijun@163.com。

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.024

R

A

1671-8348(2015)10-1365-03

2014-10-08

2014-12-12)