PI3k/Akt蛋白及mRNA在60例胃癌中的表达及意义*

程 玉，李建玲，刘海旺，李春辉△

(承德医学院附属医院：1.病理科；2.麻醉科，河北承德 067000)



PI3k/Akt蛋白及mRNA在60例胃癌中的表达及意义*

程 玉1，李建玲2，刘海旺1，李春辉1△

(承德医学院附属医院：1.病理科；2.麻醉科，河北承德 067000)

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)在胃癌组织及远端正常组织中的表达情况，分析其表达与胃癌临床病理特征之间的关系。方法 应用免疫组化S-P法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测60例胃癌组织和25例正常胃组织(距癌边缘10 cm以上的胃组织)中PI3K、Akt蛋白及mRNA的表达。结果 PI3K、Akt在胃癌组织中的表达均明显高于在远端正常胃组织中的表达，差异有统计学意义(P<0.01)，二者在胃癌组织中的表达均与胃癌的分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移情况相关(P<0.05)。结论 PI3k/Akt蛋白及mRNA参与了胃癌的发生、发展、浸润转移，在胃癌的癌变过程中起着重要作用。

胃肿瘤；1-磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶；免疫组织化学；逆转录聚合酶链反应

近年来，随着分子生物学的发展，信号转导通路已成为肿瘤发病机制和靶向治疗研究的热点。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号转导通路在多种肿瘤的发生、发展过程中都扮演着重要角色[1-2]。本研究利用免疫组化和逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)技术从蛋白和基因水平观察PI3K、Akt在胃癌和远端正常组织中的表达，分析PI3K/Akt蛋白及mRNA与胃癌临床病理特征的关系，探讨其在胃癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集承德医学院附属医院2012年7月至2013年2月手术切除的胃癌组织60份(胃癌组)及距癌边缘10 cm以上正常胃组织25份(对照组)，术前均未行化疗、放疗，所有病例经术后病理学检查证实为胃腺癌，相应癌旁组织均未见癌细胞累及。60例胃癌患者中，男45例、女15例；年龄45～77岁，中位50岁；高中分化者24例、低分化者36例，Ⅰ、Ⅱ期患者28例，Ⅲ、Ⅳ患者32例，癌组织穿透浆膜者48例，有淋巴结转移者35例。所有标本离体后立即分为两份，一份在离体后30 min内储存在-80 ℃冰箱里，另一部分离体后立即置于10%福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人PI3K (P85α亚型)、Akt1/2浓缩型多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，工作浓度1∶100。RT-PCR试剂盒及DNA Marker购自宝生物工程有限公司(大连)，PCR引物由北京赛百盛基因技术有限公司设计合成。P85α上游引物：5′-TGC TAT GCC TGC TCT GTA GTG GT-3′，下游引物：5′-GTG TGA CAT TGA GGG AGT CGT TG-3′，扩增片段为175 bp；Akt上游引物：5′-GTG CTG GAG GAC AAT GAC TAC GG-3′，下游引物：5′-AGC AGC CCT GAA AGC AAG GA-3′，扩增片段为194 bp；β-actin上游引物：5′-AGC GGG AAA TCG TGC GTG AC-3′，下游引物：5′-ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC-3′，扩增片段为453 bp。

1.2.2 免疫组化检测 采用S-P法，严格按照说明书实验步骤进行操作。最后组织切片用PBS替代PI3K、Akt作为阴性对照，用已知阳性切片做阳性对照。PI3K、Akt阳性染色呈黄色至棕黄色，主要定位于癌细胞细胞质。在染色均匀的区域，选取5个高倍镜视野(×200)，(1)按阳性细胞百分率(A值)评分：1%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%为3分；(2)按染色强度(B值)评分：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项得分相加小于或等于2分为阴性，>2分为阳性。

1.2.3 RT-PCR检测 采用Triozol试剂盒分别提取胃癌及远端正常胃组织总RNA，分析其完整性、纯度和浓度，并作RT-PCR检测。PI3K的循环条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸5 min。Akt的循环条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸5 min。β-actin的循环条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行定性检测，相应位点出现单一电泳条带为阳性表达。以β-actin做内参照，电泳结果用凝胶图像分析系统进行光密度测定。

2 结 果

2.1 两组PI3K、Akt蛋白表达情况及二者的相关性PI3K蛋白在60份胃癌组织中，阳性表达52份(86.67%)，Akt蛋白在60份胃癌组织中，阳性表达43份(71.67%)；二者在25份正常组织中无表达或弱阳性表达，PI3K、Akt在胃癌组织中的阳性表达明显高于在正常胃组织中表达，差异有统计学意义(P<0.01)。且二者的表达呈正相关关系(r=0.297，P<0.05)，见表1、2。

表1 PI3K和 Akt蛋白在两组标本组织中的表达

表2 在胃癌中PI3K和 Akt蛋白表达的相关性

2.2PI3K、Akt蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系PI3K、Akt蛋白的表达与患者的年龄、性别均无相关(P>0.05)，而与胃癌的分化程度、肿瘤分期、浸润深度及淋巴结转移情况均密切相关(P<0.05)，见表3、图1。

表3 PI3K和 Akt蛋白表达与胃癌临床特征的相关性

续表3 PI3K和Akt蛋白表达与胃癌临床特征的相关性

2.3 两组PI3K、AktmRNA表达比较 胃癌组织中PI3K与β-actin、Akt与β-actin的灰度值比显著高于远端正常胃组织(图2)，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 两组PI3K、Akt mRNA表达比较

2.4PI3K、AktmRNA表达与胃癌临床病理特征的关系 胃癌组织中PI3K、AktmRNA的表达与患者的年龄、性别均无相关(P>0.05)，而与肿瘤的分化程度、肿瘤分期、浸润深度及淋巴结转移情况均密切相关(P<0.05)，见表5。

表5 PI3K、Akt mRNA的表达与胃癌

图1PI3K及Akt蛋白在两组标本组织中的表达 (×200)

M：标记物；1:正常胃黏膜；2:高-中分化胃癌组织；3:低分化胃癌组织。

图2PI3K、AktmRNA在两组标本中的表达

3 讨 论

PI-3K/Akt信号转导通路是一条酪氨酸激酶级联信号通路，其中PI3K是此信号通路的始动因子。Src、Ras、Rac、Abl、v-Crk等具有酪氨酸激酶活性的癌性蛋白可与PI3K的调节亚基p85结合而发生作用，这些癌性蛋白的异常活化可使PI3K持续活化,引致细胞形态改变、凋亡受阻，导致细胞转化及过度增殖[3]。PI3K还可以将具有PH结构域的信号分子Akt招募到质膜上进行活化，活化的Akt进一步激活下游信号分子，对细胞功能进行调控[4]。通过对底物的磷酸化，Akt可阻断代谢抑制激酶如腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)的活性[5]，上调细胞的新陈代谢活性[6]；并且其还可使细胞周期激酶抑制剂p21、p27失活，从而促进细胞生长、存活及肿瘤生成。本研究结果显示，PI3K、Akt在胃癌组织中的表达明显高于在远端正常组织中的表达，差异有统计学意义(P<0.01)，且随着胃癌分化程度高→中→低变化，TNM分期Ⅰ、Ⅱ期→Ⅲ、Ⅳ期改变，PI3K、Akt阳性表达明显增高，提示PI3K/Akt信号转导通路与胃癌的发生与发展有关。本实验结果与Horiguchi等[7]的报道中提及的胃癌中Akt激酶活性增高的现象一致。Osaki等[8]发现，在在胃癌细胞系MKN-45中，PI3K/Akt信号转导通路在抵抗Fas调节的凋亡中起重要作用。已有研究发现Akt上游调节器肝细胞生长因子(HGF)及其受体c-Met高表达于胃癌中，c-Met小分子量抑制剂PHA-665752可减少Akt信号的激活，使胃癌异种移植模型中肿瘤细胞减少[9]。PI3K/Akt信号转导通路可将有丝分裂信号传递给p70s6k，使细胞周期素(cyclin)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)等细胞周期主要蛋白的翻译上调，同时抑制CDK4的表达，促进G期进展，使细胞周期加速，促进细胞增殖和分化，从而促进肿瘤的发生、发展[10]。

本研究还发现随着胃癌浸润程度的增加，淋巴结转移灶的出现，PI3K、Akt的阳性表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示PI3K/Akt信号转导通路参与了胃癌的浸润转移。活化的PI3K/Akt信号转导通路可以上调基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9mRNA和蛋白的表达，降解细胞外基质，突破基底膜，促进侵袭浸润[11]。Akt能磷酸化GSK3β，拮抗β-CAT的降解，增高其浓度，从而下调E-钙黏素表达最终减弱了细胞的黏附能力[12]。活化的Akt还可以增加NF-KB的转录活性，增加肿瘤细胞的运动功能，有助于癌细胞侵袭。Akt还能上调胰腺癌细胞的胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)，IGF-IR在许多恶性肿瘤中过表达并且与肿瘤细胞的侵袭与转移相关[13-14]。

综上所述，本实验从基因和蛋白水平证实了PI3K、Akt在胃癌组织中高表达，PI3K/Akt信号转导通路参与了胃癌的发生、发展及侵润转移等生物学行为。进一步扩大研究对象并采用多种研究方法检测PI3K、Akt与胃癌的临床病理意义，可能为胃癌的早期诊断寻找到敏感标志物并且为临床治疗提供新的靶点。

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Expression of PI3k/Akt protein and mRNA in 60 cases of gastric carcinoma and its significance*

ChengYu1,LiJianling2,LiuHaiwang1,LiChunhui1△

(1.DepartmentofPathology；2.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofChengdeMediecalCollege,Chengde,Hebei067000,China)

Objective To explore the expression of phosphoinositide 3 kinase (PI3K) and Akt in gastric carcinoma tissues and the distal normal tissues,and to analyze their correlation with the clinical pathologic characteristics of gastric cancer.Methods The S-P immunohistochemistry and RT-PCR were used to detect the expression of PI3K and Akt protein and mRNA in 60 cases of gastric carcinoma tissues and 25 cases of normal gastric mucosal tissues.Results The expression of PI3K and Akt in the gastric carcinoma tissues was significantly higher than that in the distal normal gastric tissues with statistical difference (P<0.05) and their expression in gastric carcinoma tissues was significantly related with the pathologic differentiation degree,TNM stage,invasion depth and lymph node metastasis (P<0.05).Conclusion PI3k/Akt protein and mRNA participate in the occurrence,development,infiltration and metastasis process of gastric cancer,and play an important role in the canceration of gastric carcinoma.

stomach neoplasms;1-phosphatidylinositol 3-kinase;protein-serine-threonine kinase;immunohistochemistry;reverse transcriptase polymerase chain reaction

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.020

河北省医学科学研究重点课题(ZL20140103)。 作者简介：程玉(1988-)，在读硕士研究生，主要从事胃癌的基础与临床研究。△

,Tel:15633142839;E-mail：chli612@126.com。

R735.2

A

1671-8348(2015)10-1352-03

2014-11-15

2014-12-10)