尘螨疫苗免疫治疗下调哮喘小鼠气道IL-17的表达*

吕 勤,杨小猛,肖小军,陈 思,杨平常,刘志刚,张 敏△

(1.深圳大学第一附属医院呼吸内科 518035;2.深圳大学过敏反应和免疫学研究所 518060)



·论 著·

尘螨疫苗免疫治疗下调哮喘小鼠气道IL-17的表达*

吕 勤1,杨小猛2,肖小军2,陈 思2,杨平常2,刘志刚2,张 敏1△

(1.深圳大学第一附属医院呼吸内科 518035;2.深圳大学过敏反应和免疫学研究所 518060)

目的 探讨尘螨疫苗免疫治疗对尘螨过敏性哮喘小鼠气道IL-17表达的影响。方法 24只BAL B/c小鼠随机分为正常对照组(A组)、哮喘对照组(B组)和尘螨疫苗治疗组(C组)，每组8只。A组小鼠始终采用生理盐水处理；B、C组小鼠采用尘螨过敏原经腹腔建立尘螨过敏性哮喘小鼠模型后，B组采用生理盐水治疗，C组采用粉尘螨疫苗治疗。治疗7 d后采用尘螨粗提液雾化激发B、C组小鼠，末次激发24 h后取小鼠肺组织采用HE染色观察炎性反应变化，取小鼠气道采用免疫组化法分析IL-17浓度，取小鼠脾细胞培养上清液采用ELISA法测定IL-17浓度。结果 光镜下可见B组小鼠肺组织结构紊乱、充血及水肿，有大量炎性细胞浸润，而A、C组小鼠肺组织未见明显病理变化。B组小鼠气道IL-17表达明显高于A、C组小鼠。同时B组小鼠脾细胞培养上清液IL-17浓度显著高于A、C组小鼠(P<0.01)，而A、C组小鼠脾细胞培养上清液IL-17浓度差异无统计学意义(P>0.05)。结论 尘螨疫苗免疫治疗可降低尘螨过敏性哮喘小鼠气道IL-17的表达，减轻尘螨过敏性哮喘小鼠气道炎性反应。

尘螨疫苗； 免疫治疗； 哮喘； IL-17

白细胞介素17(IL-17)是近年来发现的主要由CD4+T细胞分泌的细胞因子，是一种较强的前炎性细胞因子，也是炎性反应的微调因子。IL-17是哮喘等过敏性疾病相关细胞因子网络的重要成员之一，在T细胞激活、气道的中性粒细胞募集及活化、气道高反应等方面具有重要作用，参与了气道炎性反应及气道重塑。IL-17在哮喘的发生、发展中发挥重要作用，IL-17可以加重哮喘小鼠模型的气道高反应性和气道炎症[1]，而IL-17基因缺陷的小鼠则不易诱发哮喘[2]。粉尘螨变应原是诱导哮喘和其他过敏反应疾病中最重要的变应原之一[3-4]，尘螨疫苗免疫治疗是目前唯一对因治疗过敏哮喘的有效方法，而尘螨疫苗免疫治疗对哮喘患者气道IL-17表达的影响尚不清楚，本研究拟建立粉尘螨过敏性哮喘小鼠模型，并采用尘螨疫苗免疫治疗，研究尘螨疫苗免疫治疗对哮喘小鼠模型气道IL-17表达的调节作用，从而为治疗哮喘提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 BAL B/c小鼠(雌性，4～6周龄，SPF级)购自广东省实验动物中心，饲养于深圳大学医学院SPF级动物实验室。小鼠IL-17检测试剂盒购自美国Biolegend公司(ELISA法)，小鼠IL-17单克隆抗体购自美国Santa公司，免疫组化通用试剂盒购自日本DAKO公司，HE染色试剂盒购自珠海贝索公司。

1.2 方法

1.2.1 粉尘螨粗蛋白的提取 将研钵、匀浆器洗净烘干备用。称取-20 ℃保存的粉尘螨4 g，倒入研钵中，用液氮充分研磨成粉末，转移到匀浆器中，加入5 mL PBS缓冲液和适量的蛋白酶抑制剂，冰上操作，充分匀浆2 h，然后4 ℃下搅拌2 h。4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，吸取中间层蛋白，避免吸到最上层的脂质和沉淀。再按照上述方法离心2～3次，直到溶液完全澄清。用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，经0.22 μm的无菌滤膜过滤，以去除杂质和细菌，-80 ℃保存备用。

1.2.2 粉尘螨过敏性哮喘小鼠模型的建立及实验方案 将24只BAL B/c小鼠随机分成正常对照组(A组)、哮喘对照组(B组)和尘螨疫苗治疗组(C组)，每组8只。A组始终采用生理盐水处理，B、C组小鼠于第0、7、14天每只腹腔注射200 μL致敏液(含尘螨粗蛋白50 μg、氢氧化铝佐剂2 mg)致敏。第28天后，B组用生理盐水200 μL代替致敏液，C组用粉尘螨疫苗100 μg+2 mg氢氧化铝佐剂，腹腔注射，每2 d注射1次，连续8次。1周后，B、C组小鼠置于自制小鼠雾化吸入箱中，以10 μg/mL尘螨粗提液(以PBS稀释)雾化吸入激发，每天雾化30 min，连续雾化7 d，观察并记录小鼠哮喘发作情况。

1.2.3 气道高反应性测定 小鼠最后一次激发24 h后开始试验，将3组实验小鼠分别装入4个相同容器内，首先用PBS雾化喷入4个容器中，用于测量基础增强呼吸间歇(Penh)值作为气道反应性变化的指标；再依次雾化喷入6.25、12.5、25、50、100 mg/mL醋甲胆碱，每次雾化喷入后5 min记录1次Penh值，每2个浓度的检测之间有1个短暂的间歇，使呼吸强度回到基线水平。以PBS激发的Penh值为基础值，绘制不同醋甲胆碱浓度激发下Penh值的变化百分比曲线，观察Penh值的变化。

1.2.4 气道和肺部病理变化及IL-17浓度分析 取气道和右肺中叶于4%多聚甲醛(含1‰DEPC)中固定48 h，石蜡包埋，切片(厚度3 μm)。HE染色法观察病理变化，严格按免疫组化法试剂盒说明书观察IL-17浓度变化。

1.2.5 脾细胞培养上清液IL-17浓度的测定 无菌条件下取出小鼠脾脏，过无菌的200目滤网，用RPMI-1640不完全培养基重悬脾细胞，加入EDTA-NH4Cl红细胞裂解液，离心收集脾细胞。然后再用含100 mg/L胎牛血清、100 U/L青霉素及100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基重悬脾细胞制成脾细胞悬液，24孔培养板培养脾细胞，每孔加2 mL，细胞密度为5×106/孔，加入刀豆蛋白(每孔200 μg)刺激脾细胞，同时设立阴性对照组，恒温培养箱培养72 h，收集培养液，4 ℃条件下1 500 r/min离心5 min，取上清液，严格按试剂盒说明书操作，观察IL-17浓度变化。

2 结 果

2.1 3组小鼠气道高反应性比较 当醋甲胆碱浓度大于或等于25 mg/mL时，随醋甲胆碱浓度升高，3组小鼠Penh值均不断升高；B组气道高反应性均显著高于A组(P<0.01)和C组(P<0.01)；C组Penh值均略高于A组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 3组小鼠气道和肺部病理变化比较 A组切片结构完整清晰，支气管纤毛排列整齐，无水肿和炎性渗出，气管和血管周围未见炎性细胞浸润(图2A)；B组肺组织切片肺泡网状结构消失，结构紊乱、管腔内炎性渗出增多，周围有大量炎性细胞浸润，肺组织有明显水肿和损伤(图2B)；C组肺组织基本恢复网状结构，较哮喘组完整，支气管周围炎性细胞浸润较B组明显减少，C组水肿及炎性渗出亦明显减少(图2C)。

图1 3组小鼠气道高反应性比较

图2 3组小鼠气道和肺部病理变化比较 小鼠肺组织HE染色图

2.3 3组小鼠气道和肺组织IL-17浓度比较 图3中A、B、C分别为A组、B组、C组小鼠气道和肺组织的免疫组化图，由图3可见，B组小鼠IL-17浓度明显高于A组，经尘螨疫苗治疗后，C组小鼠气道IL-17表达明显减弱。

注：箭头所示为IL-17表达阳性。

图3 3组小鼠气道和肺组织IL-17浓度免疫组化图

2.4 3组小鼠脾细胞培养上清液IL-17浓度比较 A、B、C组小鼠脾细胞培养上清液IL-17浓度分别为(48.27±4.14)、(85.13±2.36)、(51.21±2.32)pg/mL。B组显著高于A组(t=21.878,P<0.01)和C组(t=28.990,P<0.01)；C组略高于A组，但差异无统计学意义(t=1.752,P>0.05)。

3 讨 论

过敏性哮喘是一种以肺部嗜酸性粒细胞浸润、黏液过度分泌、对特异性抗原产生气道高反应性为特征的慢性气道炎性疾病[5]，其主要病理特征为气道炎症、气道高反应性和气道重塑。IL-17、IL-4、IL-10等多种细胞因子参与过敏性哮喘的进程，影响哮喘发生和发展，贯穿疾病始终。其中IL-17通过募集中性粒细胞、巨噬细胞浸润及诱导黏液分泌等参与哮喘的病理过程，促进炎性反应，与哮喘的加重密切相关[6]。IL-17是一种主要由CD4+T细胞、嗜酸性粒细胞等分泌的前炎性细胞因子，参与机体多种炎性疾病的发生和发展，特别是与肺部感染、哮喘等疾病有着密切的关系，IL-17可以通过促进气道组织纤维化进而引起呼吸道重塑，促进哮喘的发生、发展。

尘螨疫苗是目前唯一对因治疗哮喘的有效药物，用于治疗儿童过敏性哮喘，全身不良反应发生率相对较低，安全性较高，有临床实用价值[7]，而尘螨疫苗免疫治疗对哮喘患者气道IL-17表达的影响尚不清楚。本研究采用尘螨粗蛋白和氢氧化铝佐剂按常规方法构建哮喘小鼠模型，使用尘螨疫苗进行免疫治疗并测定气道高反应性，结果发现B组气道高反应性均显著高于A组和C组，而经尘螨疫苗治疗的C组小鼠的哮喘症状如烦躁不安、毛发竖起、呼吸加快加深等均有所改善，提示本研究成功建立了尘螨过敏性哮喘小鼠模型，尘螨疫苗对哮喘有效且可以降低气道高反应性。

有研究显示，IL-17在哮喘中发挥着重要作用，IL-17表达水平与气道高反应性和临床严重程度有关[8-10]；卵清蛋白致敏性支气管哮喘小鼠肺组织中IL-17 mRNA和蛋白水平均高于正常小鼠[11]。本研究发现B组小鼠脾细胞培养上清液中IL-17浓度较A组和C组均显著升高，而C组小鼠脾细胞培养上清液中IL-17浓度与A组相近，同时肺组织病理及免疫组化结果亦证实尘螨疫苗治疗后的C组小鼠气道和肺组织IL-17浓度显著低于B组，提示IL-17在哮喘发生和发展中起着重要作用，尘螨疫苗免疫治疗可能通过降低IL-17的表达减轻哮喘炎性反应及气道高反应性。

[1]Mizutani N,Nabe T,Yoshino S.IL-17A promotes the exacerbation of IL-33-induced airway hyperresponsiveness by enhancing neutrophilic inflammation via CXCR2 signaling in mice[J].J Immunol,2014,192(4):1372-1384.

[2]Choi JP,Kim YS,Tae YM,et al.A viral PAMP double-stranded RNA induces allergen-specific Th17 cell response in the airways which is dependent on VEGF and IL-6[J].Allergy,2010,65(10):1322-1330.

[3]Sade K,Roitman D,Kivity S.Sensitization to Dermatophagoides,Blomia tropicalis,and other mites in atopic patients[J].J Asthma,2010,47(8):849-852.

[4]陈代雄,周平坤,冉丕鑫,等.屋尘螨和粉尘螨主要变应原的筛选和分析[J].中国热带医学,2009,9(2):232-234.

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[6]Iwakura Y,Ishigame H,Saijo S,et al.Functional specialization of interleukin-17 family members[J].Immunity,2011,34(2):149-162.

[7]柴若楠,林小平,谢华,等.阿罗格尘螨疫苗治疗儿童哮喘安全性评价[J].临床军医杂志,2012,40(2):428-430.

[8]Barczyk A,Pierzchala W,Sozaska E.Interleukin-17 in sputum correlates with airway hyperresponsiveness to methacholine[J].Respir Med,2003,97(6):726-733.

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[10]Chien JW,Lin CY,Yang KD,et al.Increased IL-17A secreting CD4+T cells,serum IL-17 levels and exhaled nitric oxide are correlated with childhood asthma severity[J].Clin Exp Allergy，2013,43(9):1018-1026.

[11]胡斯明,罗雅玲,赖文岩,等.地塞米松对哮喘小鼠Th17细胞因子IL-17表达的影响[J].南方医科大学学报,2009,29(6):1185-1188.

Dust mite vaccine immunotherapy down-regulate the level of IL-17 in asthma mice*

LYUQin1,YANGXiao-meng2,XIAOXiao-jun2,CHENSi2,YANGPing-chang2,LIUZhi-gang2,ZHANGMin1△

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,FirstAffiliatedHospitalofShenzhenUniversity,Shenzhen,Guangdong518035,China;2.AllergiesandImmunologyInstitute,ShenzhenUniversity,Shenzhen,Guangdong518060,China)

Objective To investigate the effects of dust mite vaccine immunotherapy on the level of IL-17 in asthma mice.Methods 24 BAL B/c mice were randomly divided into the control group (group A),asthma group (group B) and dust mite vaccine treatment group (group C),with 8 mice in each group.Group A were treated by normal saline.Group B and C received intraperitoneal injection of dust mite allergen to establish dust mite allergic asthma mice model.Group B were treated by normal saline.Group C were treated by dust mite vaccine.Group B and C were stimulated by allergens extracted from whole house dust mite after 7 d treatment.24 h after the last challenge,lung tissue were obtained to observe the inflammatory changes using HE staining; airway were obtained to analyze the level of IL-17 using immunohistochemical method; splenocytes were obtained and cultured,and the level of IL-17 in the supernatant were tested using ELISA.Results Lung tissues in group B showed structural disorder,congestive and edema,inflammatory cells infiltration at light microscopy level,but lung tissues in group A and C showed little pathological changes.IL-17 expression in airway in group B was higher than those in group A and C significantly.Meanwhile,the levels of IL-17 in the supernatant in group B were higher than those in group A and C obviously(P<0.01);and there was no significant difference between group A and C(P>0.05).Conclusion Dust mite immunotherapy vaccine might lessen airway inflammation in dust mite allergic asthma mice through down-regulating the expression of IL-17 in airway in asthma mice.

dust mite vaccine; immunotherapy; asthma; IL-17

国家自然科学基金资助项目(81300028、31328014);广东省高等学校国际暨港澳台科技合作创新平台项目(2012gjhz0009);广东省深圳市科技计划项目(JCYJ20120613173913654、JCYJ20130329110735981、JCYJ20120613173233810)。

吕勤，女，硕士，主治医师，主要从事呼吸内科基础与临床研究。△

，E-mail：sysu_microbiology@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.002

A

1672-9455(2015)20-2974-02

2015-03-25

2015-07-02)