HBsAb 滴度高于10 000 mU/ml 外周血BCR CDR3 受体库的组成及特征分析①

潘 娟 石 彬 马 龙 姚新生 (遵义医学院附属医院检验科，遵义 563003)

一直以来，乙型肝炎病毒(HBV)感染都是全球性的公共卫生问题，全世界约有3.5 亿人为慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者［1］。而根据我国卫生部2008 年4 月统计结果，目前我国有0.93 亿人受HBV 感染［2］。注射乙肝疫苗，诱导机体B 细胞产生乙肝抗体，无疑是防患于未然的重要措施。但多次调查和研究表明，通过接种现有乙肝疫苗只有约90%左右人群产生HBsAb，而有5%～15%的人群基本不产生HBsAb，其不应答的机制目前尚未完全阐明［3，4］。有研究表明乙型肝炎人免疫球蛋白(HBIg)可有效阻断母婴传播，也可保护各种易感人群［5，6］。但是，目前HBIg 是从健康献血员中筛选而来，作为血液制品，原材料不足，成本昂贵，导致货源紧缺。2013 年，我们通过统计发现，普通人群中约有千分之六左右的人外周血HBsAb 滴度高达10 000 mU/ml 以上，追踪发现这类人群无任何病毒性肝病历史和病毒性肝病倾向，这表明抗体保护效果好，且在研究期间维持在高水平，这说明抗体稳定。那HBsAb 滴度高达10 000 mU/ml 以上的人群为何能产生这么高的HBsAb 滴度，又能稳定维持在高水平且能起到很好的保护作用?本研究分析HBsAb 滴度高达10 000 mU/ml 以上样本BCR CDR3受体库的组成和特征，通过比对分析寻找可能的高亲和力HBsAb 序列，为后续研究提供坚实的实验数据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 从遵义医学院附属医院检验科检测乙肝五项的日常临床标本中，筛选出HBsAb 滴度高于10 000 mU/ml 而表面抗原阴性的样本，并排除肝脏相关疾病及其他肿瘤等疾病。

1.2 主要仪器和试剂 ARCHTTECTI 2000sr 全自动免疫分析仪(雅培上海商贸有限责任公司);Illumina SEQ 高通量测序系统(美国Adaptive Biotechnologies 测序平台);乙型肝炎病毒测定试剂盒(Abbott GmbH＆Co.KG 公司);淋巴细胞分离液(国药集团化学试剂有限责任公司);DNA Marker(Tiangen 公司);DNA 提取试剂盒(Qiagen 公司)。

1.3 DNA 样本制备及测序 采集符合要求的样本外周血2 ml (EDTA-K2 抗凝)，Ficoll 密度梯度离心法分离PBMC，商品试剂盒法提取淋巴细胞基因组DNA，外送美国 Adaptive Bio-technologies ImmunoSEQ 测序平台进行Illumina 高通量测序。

1.4 数据分析 所获得的测序数据及NCBI 数据库中HBsAb 序列通过目前权威数据库IMGT/High V-QUEST 在线软件进行分析。

2 结果

2.1 研究对象 B4、B5 为测序样本，其性别、年龄和乙肝五项结果等临床基本资料见表1。

2.2 数据的初步分析结果 测序结果经IMGT/High V-QUEST 在线软件初步分析，再经过Excel 2010 进一步筛选用作分析的总序列及独特序列，结果见表2。

2.3 IGHV/D/J 基因家族的分布、IGHV-J 配对取用、CDR3 区长度分布及氨基酸取用情况 HBsAb滴度高于10 000 mU/ml 样本B4、B5 BCR CDR3 区，均最高频取用IGHV3、IGHV4，IGHJ4、IGHJ6 及IGHD3、IGHD6 基因亚群，见图1。在IGHV-J 配对取用上，均最高频取用配对IGHV3-J4、IGHV3-J6，见图2。B4、B5 BCR CDR3 区长度以14 及15 个氨基酸长度为中线呈正态分布，最高频取用的氨基酸依次为酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)，两端位点保守取用氨基酸，中间位点呈现氨基酸多样性取用，见图3。

表2 各样本数据的初步统计分析结果Tab.2 Preliminary analysis data of each sample

图1 IGHV/D/J 基因家族的分布Fig.1 Distribution of IGHV/ D/J gene subgroups

图2 IGHV-J 配对取用Fig.2 IGHV-J matching

图3 CDR3 区长度分布及氨基酸取用情况Fig.3 CDR3 length and amino acids frequency

表3 与NCBI 数据库HBsAb H-CDR3 比对结果Tab.3 Comparison results between B4 B5 with NCBI HBsAb H-CDR3

2.4 与NCBI 数据库中HBsAb 比对结果 从NCBI数据库中获得人源HBsAb 序列13 条，人工合成的HBsAb 序列105 条，B4、B5 BCR CDR3 受体库与其比较，未发现完全相同的CDR3 序列。通过IMGT/High V-QUEST 分析，获得7 条可比对分析序列，将B4、B5 BCR CDR3 序列与之比对，得到V 基因、J 基因、CDR3 长度完全一致的总序列数为1 160 条，独特序列48 条，见表3。

3 讨论

生物体在长期的种系进化过程中形成一系列防御机制，包括固有免疫和适应性免疫，同时形成了多种抗原识别机制，其中B 细胞特异性识别抗原和抗体形成及分泌作为适应性免疫的核心问题，一直受到广泛关注。B 细胞受体(B cell receptor，BCR)作为B 细胞识别抗原的重要分子也一直受到多方面研究，并在单克隆抗体制备、疫苗研发等领域有广泛应用。近年来，随着第二代高通量测序技术的发展，使得对个体BCR 受体库全面分析成为可能，并在免疫组库、全基因组库、转录组库等等方面得到广泛应用［7-9］，其中Illumina 的Solexa 测序技术因拥有三高一低(数据通量高、准确度高、敏感性高但成本相对较低)的独特优势使其广泛应用于各个研究领域［10-12］。

近几年来，高通量测序技术也应用到了单克隆抗体的筛选和制备［13-15］。Jin 等［16，17］用酶联免疫斑点微阵列芯片分选乙肝疫苗志愿者外周血抗体分泌B 细胞，结合测序技术分析B 细胞抗体基因特征并成功制备了乙肝单克隆抗体，Zhang 等［18］人利用高通量测序技术，通过免疫BALB/c 小鼠也获得乙肝单抗。这几年，我们实验室一直致力于研究TCR 及BCR CDR3 受体库的组成和特征，前期课题组实验利用第二代高通量测序技术初步分析了人HBV 疫苗接种前、后B 细胞H 链CDR3 受体库的组成和特征。在临床工作中，我们发现部分人群HBsAb 滴度水平超出仪器检测上限，在2013 年，我们通过统计发现普通人群中约有千分之六左右的人外周血HBsAb 滴度高达10 000 mU/ml 以上。以往多数研究的是乙肝疫苗志愿者，其抗体水平处于一般水平位，而HBsAb 滴度高达10 000 mU/ml 以上人群为何能产生这么高的HBsAb 滴度?又能稳定维持在高水平?且能起到很好的保护作用?这类人群是否具有高产高亲和力的抗体基因?本实验利用Illumina Solexa 高通量测序技术及权威数据库IMGT 中的High V-QUEST 在线软件，分析HBsAb 滴度大于10 000 mU/ml 样本BCR CDR3 受体库的组成及特征，发现其在IGHV/D/J 三区及IGHV-J 配对取用上有着基本一致的特征。通过与NCBI 数据库中人源HBsAb 序列及人工合成HBsAb 序列比对分析，获得7 条可比对分析序列，以及V 基因、J 基因、CDR3 长度完全一致的总序列数1 160 条［13］，独特序列48条，已获得的48 条独特序列为后续研究提供了坚实的实验数据。

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