miR-200c 对乳腺癌BT549 细胞迁移及Slug 表达的作用①

贾莉婷 田 远 石 瑛 张琳琳 杨小倩 荣守华 张玉超 李 静

(郑州大学第三附属医院检验科，郑州 450052)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%，并呈逐年上升趋势，部分大城市报告乳腺癌已成为女性恶性肿瘤之首［1］。根据2011 年St Gallen 乳腺癌分子分型共识，利用ER、PR 和Her2 三种分子标志物，将乳腺癌分为luminal A 型、luminal B 型、Her-2阳性型和basal-like 型，其中basal-like 型乳腺癌基底样上皮分子标志物高表达，同时缺乏ER、PR 和Her-2 的表达［2］，因此该型乳腺癌侵袭性强，内分泌治疗和分子靶向治疗对其无效［1］。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是乳腺癌迁移的重要过程，其与E-钙黏连蛋白的丢失密切相关［3］。Snail 是第一个被发现的也是最重要的E-钙黏连蛋白转录抑制因子，包括三种类型:Snail1(Snail)、Snail2(Slug)和Snail3(Smuc)［4］。已有研究表明:在胶质母细胞瘤和前列腺癌细胞等肿瘤中，miR-200 具有与Slug 的结合，降低E-钙黏连蛋白的表达，进而抑制EMT、阻滞细胞迁移的能力［5，6］。miR-200 家族已经被发现在basal-like 型乳腺癌BT549 细胞中呈现低表达［7］，该家族包括五种miRNA:miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141 和miR-425［7，8］。然而，miR-200 家族在basal-like 乳腺癌中是否与Slug 具有相关性，尚未见相关报道。

本研究将以乳腺癌细胞系BT549 作为研究对象，将miR-200c 转染进入BT549 细胞中，探讨miR-200c 是否可以通过抑制Slug 基因的表达，进而上调E-钙粘连蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的迁移，以期为临床靶点治疗提供有力的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人乳腺癌细胞株BT549 购自ATCC(美国)。

1.1.2 miR-200c 合成 由Standar 公司完成miR-200c 模拟物设计。

1.1.3 主要试剂和仪器 RPMI1640 培养基购自solarbio 公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco 公司，细胞消化液Tripple 与转染试剂Lipofectamine 2000 均购自Invitrogen 公司，总RNA 提取试剂盒购自康为世纪公司，反转录试剂盒购自TaKaRa 公司，Transwell小室购自Costar 公司，Transwell Chamber 购自BD Biosciences 公司，Slug 单克隆抗体购自Stanta cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基培养BT549 细胞，并将其置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行传代培养。

1.2.2 实验分组与转染 取对数生长期细胞接种于6 孔板中，每孔细胞数量为1×105个细胞。实验分为3 组，分别为miR-200c 组(转染miR-200c组)、miR-control 组(转染空质粒组)和对照组(未转染质粒组)，每组设3 个复孔。接种24 h 后，待细胞融合率达到80%，进行转染实验。转染过程严格按照说明书进行，分别将miR-control 和miR-200c 模拟物转染到相应的BT549 细胞中，终浓度为50 nmol/L。转染6 h 后，换含血清的新鲜培养基继续进行培养。

1.2.3 总RNA 提取及反转录 Real-time PCR 将转染48 h 后的各组细胞，按照康为世纪公司的RNA提取说明书提取细胞总RNA，测定各组RNA 的浓度和纯度，并进行反转录。反转录体系为10 μl，其反应程序为:37℃，15 min;50℃，5 min;98℃，5 min;4℃，hold。反转录后进行Real-time PCR，扩增程序为:95℃，10 min;95℃，15 s;60℃，1 min。共40 个循环。以目的基因相对表达量作为判断标准。目的基因相对表达量=内参基因的CT 值/目的基因的CT 值，引物序列及扩增产物长度见表1。

1.2.4 Transwell 细胞迁移试验 在接种细胞之前，需要对Transwell 小室和24 孔板进行平衡:分别在上室加100 μl 无血清培养基，下室加600 μl FBS，置于37℃，5%CO2环境下过夜。收集转染后经过24 h 饥饿处理的各组细胞，计数后按2×104个细胞/孔接种于上室，在37℃，5%CO2环境下培养24 h，随后将上室细胞擦除，将小室膜下室侧的细胞甲醇固定，苏木素染色后进行切膜、拍照，高倍镜下取5 个视野进行计数，取其平均值，每组重复3 次。

1.2.5 Western blot 试验 收获转染48 h 后的各组细胞，并用PBS 洗涤3 次后加入混有蛋白酶抑制剂的蛋白提取液50 μl，在冰上震荡15 min，4℃条件下14 000 r/min 离心15 min，提取上清，即可得到蛋白质溶液，用BCA 法按说明书要求定量测定后，放入-80℃保存。配制12%分离胶，5%浓缩胶，将蛋白质溶液按比例加入4×loading Buffer 混匀，在95℃下变性10 min 后加样，在80 V 电压下电泳至样品游动至分离胶后改为120 V，直至样品电泳到分离胶底部。将胶中蛋白质转到NC 膜上，用1×TBS 配制的5%脱脂奶粉室温封闭2 h，弃去脱脂奶粉，加入一抗兔抗人的Slug 抗体或兔抗人的β-actin 抗体，于4℃下孵育过夜，TBST 洗涤3 次，加入羊抗兔的二抗，于室温下摇动1 h 后检测，用ODYSSEY Clx 检测与成像系统进行扫描，并拍照，分析条带的灰度值。观察三个实验组中蛋白条带颜色的深浅程度并比较。

1.2.6 划痕实验 将转染24 h 后的细胞进行划痕实验，换成无血清培养基使细胞饥饿12 h 后，用10 μl枪头在孔板中心轴处划痕;再用培养基清洗漂起的细胞，并在显微镜下拍照(0 h);在无血清培养基中，将细胞在37℃下培养24 h，再次拍照(24 h)重复实验3 次，单次实验3 个复孔。

表1 目的基因Slug 及E-钙黏连蛋白和内参基因GAPDH 的PCR 引物序列及产物长度Tab.1 Primer sequences and product length of target gene Slug，E-cadherin and internal control gene GAPDH

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件对实验结果进行统计学处理，本研究所有实验数据均采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有显著性。

2 结果

2.1 miR-200c 对乳腺癌BT549 细胞迁移的影响 Transwell 迁移试验表明:miR-200c 组分别与未转染对照组和miR-control 组相比，miR-200c 组BT549 细胞的迁移能力均明显减弱(见表2 和图1)。

表2 miR-200c 对BT549 细胞迁移能力的影响Tab.2 Effect on migration capacity of BT549 cell for miR-200c

图1 Transwell 检测miR-200c 对BT549 细胞迁移能力的影响(×400)Fig.1 Transwell migration assay of BT549 infected with miR-200c mimic(×400)

图2 划痕实验检测miR-200c 对BT549 细胞迁移能力的影响(×200)Fig.2 Wound healing assay of BT549 infected with miR-200c mimic(×200)

2.2 miR-200c 对Slug 和E-钙粘连蛋白表达的影响 Real-time PCR 实验表明:miR-200c 组分别与未转染对照组和miR-control 组相比，Slug mRNA 的表达均明显降低，E-钙粘连蛋白mRNA 的表达明显升高(见表3 和图3)。

划痕实验表明:miR-200c 组分别与未转染对照组和miR-control 组相比，miR-200c 组BT549 细胞的迁移能力明显降低(见图2)。

Western blot 试验表明:miR-200c 组分别与未转染对照组和miR-control 组相比，Slug 蛋白表达量明显降低(见图4)。

表3 三组细胞中Slug 和E-钙黏连蛋白mRNA 的表达Tab.3 Effect on expression of Slug mRNA and E-cadherin mRNA of BT549 cell for miR-200c

图3 miR-200c 对BT549 细胞中Slug 和E-钙黏连蛋白mRNA 表达的影响Fig.3 Effect on expression of Slug mRNA and E-cadherin mRNA of BT549 cell for miR-200c

图4 miR-200c 对BT549 细胞中Slug 的影响Fig.4 Effect on expression of Slug protein of BT549 cell for miR-200c

3 讨论

乳腺癌从起始到终末阶段是一个多步骤多因素的渐进过程，受到一系列基因的调控，其中EMT 过程是乳腺癌转移的一个重要的早期步骤［9］。

miRNA 作为基因的调控者，参与了EMT 过程的调控。关于miR-200 家族的研究，大多集中于其对E-钙黏连蛋白抑制物ZEB1 和ZEB2 的作用效果［10，11］。2008 年，Park 等［12］发现miR-200 家族可以与E-钙黏连蛋白转录抑制物ZEB1 和ZEB2 直接结合，并证实miR-200 家族可以通过上调E-钙黏连蛋白表达量抑制EMT 的发生。然而miR-200 家族是否对Slug 也有靶向调控能力，到目前为止还未见相关报道。在ER、PR 和Her2 阳性的乳腺癌组织中，miR-200 家族高表达，而在高侵袭性的basal-like型乳腺癌组织中表达较低［8］。因此，E-钙黏连蛋白转录抑制物Slug 或许是miR-200 家族抑制EMT 的另一个下游靶蛋白。

E-钙黏连蛋白的丢失与肿瘤EMT 的发生密切相关，E-钙黏连蛋白缺乏可以使肿瘤细胞表面粘着性降低，增强肿瘤细胞的运动性，使其从有高黏附功能的上皮细胞转化为具有低黏附功能的间质细胞［9，13］。已有研究表明:Slug 是锌指蛋白snail 家族的一员［7］，可以通过靶向结合E-钙黏连蛋白启动子的E 盒，抑制E-钙黏连蛋白的转录与表达［14，15］。本研究Real-time PCR 和Western blot 结果显示转染了miR-200c 的乳腺癌细胞系BT549 中，Slug 的表达较未转染对照组和miR-control 转染组明显降低，而E-钙黏连蛋白的表达则明显升高。因此推测，在basal-like 型乳腺癌细胞系BT549 中，miR-200c 或许可以通过抑制锌指转录蛋白Slug 来消除其对E-钙黏连蛋白的抑制作用，最终抑制EMT 的发生。

除了发现miR-200c 具有抑制Slug 的功能之外，通过进行Transwell 迁移试验和划痕实验，还发现转染了miR-200c 的乳腺癌BT549 细胞的迁移能力相比未转染对照组和miR-control 组中的细胞明显下降。这说明在细胞水平上，miR-200c 有可能通过结合Slug，促进E-钙黏连蛋白的转录与表达，抑制乳腺癌BT549 细胞EMT 的发生，最终抑制了乳腺癌BT549 细胞的迁移能力。

本研究结果完善了miR-200 家族在乳腺癌转移调控过程中一个重要的功能学意义。肿瘤的发生和发展包含众多生物学功能的改变，其中迁移能力是极为重要的因素之一，关系到肿瘤的远端转移。然而，miR-200c 调节Slug 的具体机制，还有待实验室进一步研究。

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