香菇多糖对慢性应激抑郁模型小鼠的抗抑郁作用及可能机制研究①

马 倩 蒲 燕 袁文清 吕路线 杜志敏 李万里 (新乡医学院免疫教研室，新乡 453003)

抑郁症是一种常见的心境障碍，心境低落与其处境不相称，严重者可出现自杀念头和行为［1］。尽早预防，中、西药对于抑郁症都有一定的治疗效果，心底无私天地宽，生命比欲望更重要，耐心开导患者，使患者明白一个正常的大脑比财富更重要，只有懂得这个道理，才能真正配合大夫治好抑郁症，更能让患者能够更加珍惜生命，使得患者的身体和心理得到康复［2］。患者大脑生化活性物质的紊乱是抑郁症发病的重要因素。目前的研究表明特定的药物可能导致或加重抑郁症，有些激素及类激素的活性物质具有改变情绪的作用。在抑郁症发生的众多假说中，“单胺假说”处于主导地位。多数抗抑郁药物可以提高脑组织突触内一种或多种单胺神经递质的水平［3］。从中草药、纯植物药中寻找毒性低、疗效高的抗抑郁新药已成为近年国内外研究的热点。香菇多糖(Lentinan，LNT)能够刺激免疫细胞的成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复或提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其他生物活性因子的反应性作用;LNT 还有抗肿瘤的作用，能诱导产生干扰素，具有抗病毒能力，另外LNT 还具有抗氧化、抗衰老、降血糖等多种生物学作用［4，5］。本文通过观察LNT 对慢性应激抑郁模型小鼠行为，海马组织内5-HT1A 受体表达，MDA 含量，SOD 活力以及血清中TNF-α 和IL-6 含量的影响，探讨LNT 抗抑郁症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 取健康成年昆明种小鼠40 只，雄性，体质量(20±2)g，SPF 级(郑州大学实验动物中心)，许可证号SCXK(豫)2010-002，自由进食，用1%蔗糖水喂养3 d，迫使动物改变其原来的饮水习惯。第4 天，进行24 h 禁水不禁食，第5 天再次给予1%蔗糖水4 h，测1%蔗糖水偏嗜度。根据1%蔗糖水偏嗜度和体重随机分成4 组，即正常对照组(Normal controls group，NG)、模型对照组(Model control group，MG)、LNT 剂量组(L-LNT，2.5 mg/kg;H-LNT，5.0 mg/kg)。每日1 次，在每天造模实验开始前1 h 灌胃给药，连续给药28 d。各实验组均按1.0 ml/100 g 体重给药。

1.2 主要试剂 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗，总SOD 活性检测试剂盒，(NBT 法)脂质氧化(MDA)检测试剂盒等(碧云天生物技术研究所);注射用LNT(南京绿叶思科药业有限公司);TNF-α、IL-6 ELASA 检测试剂盒(上海研域生物科技有限公司);兔抗5-HT1A 受体(Santa 公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 小鼠慢性应激抑郁模型的制造 参照文献［6］。应用轻度不可预见性的慢性应激模型，并加以改良。正常对照组，不给刺激，饮食饮水正常。而模型组及实验干预组配合孤养，禁食、禁水(24 h)，并接受不可预知的应激刺激，项目包括:噪声5 min，强光顶部照射并热烘5 min，电击足底(电压36 V，5 s×5，间隔20 s)，斜笼喂养(24 h)，夹尾3 s×5(间隔20 s)，冰水游泳4℃，5 min，50 ml 塑料离心管中制动30 min、禁水24 h，禁食24 h 等，在28 d 的实验中，每天每只动物随机仅给予一种刺激，经过编排使得5 d 内的刺激项目不重复并且不可预知。

1.3.2 陌生环境摄食实验 禁食动物在一个陌生的环境中会产生类似焦虑的冲突反应，抗焦虑药物可使动物的冲突反应降低，表现为开始吃食的潜伏期缩短。抗抑郁剂慢性给药时，在此模型上表现出同样的行为学活性，但急性给药没有此行为活性。实验时，在顶部开放的塑料盒(80×80×50)cm3底部铺约1.0 cm 厚的锯末，中间均匀摆放15 个同样大小的食块。动物禁食24 h 后，放入试验装置，计算动物开始吃食的潜伏期，吃食的判定标准是动物开始咀嚼食物，而不是仅仅嗅食或摆弄食物。以吃食的潜伏期作为参数判定药物的行为活性。实验中测试环境不同于饲养环境，测试环境的光线强度大于饲养环境，每次应从同一位置、同一方向放入小鼠。

1.3.3 强迫游泳应激实验 在建模第29 天，将小鼠放入水中15 min，诱导无助状态。小鼠强迫游泳所用水缸高25 cm，直径18 cm，水深12 cm，水温25℃。在建模后第30 天，将小鼠放入水中8 min，记录后4 min 内累计不动时间。不动是指小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面，身体没有全身运动。

1.3.4 脑组织样本制备 用10% 水合氯醛350 mg/kg ip 麻醉小鼠，然后将小鼠断头处死，迅速在冰上剥离脑组织，于预冷的PBS 冰水中清洗，正中矢状面切开，冰台上剥离一侧海马，精密称重，加入9倍预冷的0.01 mol/L PBS 制备10%海马组织匀浆，之后1 600 r/min 离心10 min 取上清用于后续测定。样品制备步骤宜在冰浴中进行操作，置于-85℃冰箱中备用。剥离另一侧脑组织置4%多聚甲醛溶液固定24 h，用蔗糖溶液4℃梯度脱水:先10%蔗糖沉底后再用15% 蔗糖12 h，20% 蔗糖12 h，最后用30%蔗糖12 h。用锡纸包好置于-70℃冰箱保存待测。

1.3.5 蛋白定量测定 用碧云天BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，按说明操作。

1.3.6 ELISA 实验 检测血清TNF-α、IL-6 的含量，采用酶联免疫吸附检测方法，按试剂盒说明书进行操作。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度。

1.3.7 SOD 酶活性检测 SOD 水平测定采用黄嘌呤氧化酶法测定，试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，适当稀释样品。根据说明进行操作。

1.3.8 脂质氧化(MDA)含量的测定 MDA 水平测定采取硫代巴比妥比色法(TBA 法)测定，根据试剂盒说明进行操作。

1.3.9 Western blot 海马组织匀浆提取蛋白，取总蛋白(50 μg)的在12% SDS-PAGE 凝胶上电泳，采用免疫蛋白印记(Western blot)技术检测5-HT1A 受体表达水平，经ImageJ 5.0 软件处理灰度值并进行评价。

1.4 统计学方法 应用SPSS18.0 统计软件进行统计分析，所有计量资料以±s 表示，采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据处理，采用LSD 法进行组间两两比较。

2 结果

2.1 LNT 对慢性应激小鼠陌生环境摄食潜伏期的影响 经过造模后的1、3、5 d 的实验观察，MG 小鼠在陌生环境中摄食潜伏期显著延长，给予LNT 干预后，能够缩短慢性应激导致小鼠在陌生环境中摄食潜伏期的延长，L-LNT 的5 d 以及H-LNT 的1、3、5 d与Model 组相比差别有显著性(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见表1。

2.2 LNT 对抑郁模型小鼠应激游泳不动时间的影响 经过造模后的1、3、5 d 的实验观察，Model 小鼠在水中应激游泳不动时间显著延长，给予LNT 干预后，能够显著缩短慢性应激导致小鼠在水中应激游泳不动时间的延长，L-LNT 的5 d 以及H-LNT 的3 d，5 d 与Model 组相比差别有显著性(P＜0.05 或P＜0.01)，见表2。

2.3 小鼠海马5-HT1A 受体表达 与正常对照NG组相比，模型组小鼠海马中5-HT1A 受体表达水平明显减少(P＜0.01)，给予不同剂量LNT 后5-HT1A受体表达增强，与模型MG 组相比，增强有统计学上的显著意义(P＜0.05 或P＜0.01)，见图1。

2.4 LNT 对小鼠海马SOD、MDA 含量的影响 慢性应激刺激后，与NG 组相比MG 组SOD 含量显著降低(P＜0.01)，LNT干预组SOD有所升高，与MG组相比H-LNT 组升高有统计学显著意义(P ＜0.01);与NG 组相比MG 组MDA 含量显著升高(P＜0.01)，LNT 干预组MDA 含量有下降趋势，与MG 组相比H-LNT 组下降有统计学显著意义(P ＜0.05)，见表3。

表1 陌生环境摄食潜伏期(±s，n=10，s)Tab.1 Strange environment feeding latency(±s，n=10，s)

表1 陌生环境摄食潜伏期(±s，n=10，s)Tab.1 Strange environment feeding latency(±s，n=10，s)

Note:Vs NG，1)P＜0.01;vs MG，2)P＜0.05，3)P＜0.01.

表2 小鼠应激游泳不动时间(±s，n=10，s)Tab.2 Stress non swimming time(±s，n=10，s)

表2 小鼠应激游泳不动时间(±s，n=10，s)Tab.2 Stress non swimming time(±s，n=10，s)

Note:Vs NG，1)P＜0.01;vs MG，2)P＜0.05，3)P＜0.01.

表3 LNT 对慢性应激小鼠模型小鼠海马SOD、MDA 含量的影响(±s，n=10)Tab.3 Effect of LNT on content of SOD，MDA in hippocampus of mice(±s，n=10)

表3 LNT 对慢性应激小鼠模型小鼠海马SOD、MDA 含量的影响(±s，n=10)Tab.3 Effect of LNT on content of SOD，MDA in hippocampus of mice(±s，n=10)

Note:Vs NG，1)P＜0.01，2)P＜0.05，vs MG，3)P＜0.01.

图1 LNT 对小鼠海马5-HT1A 受体表达的影响Fig.1 Effect of LNT on expression of 5-HT1A receptor in hippocampus of mice

图2 LNT 对小鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平的影响Fig.2 Effect of LNT on serum level of TNF-α and IL-6 in mice

2.5 LNT 对抑郁模型小鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平的影响 给予慢性应激刺激后，模型组小鼠血清中TNF-α 和IL-6 明显增多，给予不同剂量LNT 后血清中TNF-α 和IL-6 明显减少(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见图1、2。

3 讨论

香菇多糖(Lentinan，LNT)的免疫调节作用是其生物活性的重要基础。LNT 具有典型的T 细胞激活剂的功能，促进白细胞介素的产生，还能促进单核巨噬细胞的功能，目前已经被认为是一种特殊免疫增强剂。有抗肿瘤活性。在体内能使脾脏和腹腔的NK 细胞活性增强，诱生细胞因子的产生，其活性与白细胞介素类或干扰素诱导剂有协同作用。本实验表明慢性应激导致的自发活动减少，小鼠平均游泳不动时间延长，模型组均较对照组显著增加，LNT 能显著改善慢性应激导致的游泳不动时间的延长，结合陌生环境摄食的实验结果，慢性应激导致小鼠在陌生环境中平均摄食潜伏期显著延长，给予LNT 可显著缩短平均摄食潜伏期，表明LNT 在此抑郁模型上具有抗抑郁活性，抑郁症的研究离不开有效动物模型的建立，国内外已有学者分别用糖皮质激素、孤养、电诱导、药物诱导、嗅球切除、转基因动物等方法来构建抑郁症动物模型。通过CUMS 模型有效模拟了人们在日常生活中所遇到的不良环境［7］。有药理学实验结果表明［8］，随着5-HT 再摄取抑制剂的使用，患者血清中5-HT 的浓度增高，患者的躯体僵直及运动迟缓得到改善，但是药物治疗的起效出现延迟，这表示该种机制仅为抑郁症发病机制的一部分，这些变化可能反映血清素代谢的大脑突触的改变。而神经可塑性机制的存在，一定程度上解释了这种效应延迟现象。我们的研究证实:模型小鼠出现海马内5-HT 含量及5-HT1A 受体表达降低，LNT干预后5-HT 含量升高及5-HT1A 受体表达增强有助于缓解抑郁症的症状。

MDA 含量升高能使细胞膜变性、坏死，使DNA发生突变、断裂、交链，并使SOD 的生物活性降低。近来研究表明，大脑在损伤的过程中，神经细胞膜不饱和脂肪酸被氧化将产生大量的自由基，造成细胞生物膜损伤，产生炎症反应，最终将导致细胞凋亡、退行性病变，并进一步引起大脑损伤连锁反应的恶性循环。海马在大脑中作为边缘系统的重要结构，在情绪形成、学习记忆以及内脏活动调节等诸多方面均发挥着重要作用。在抑郁症发病中海马起着重要的作用，有研究表明抑郁症患者的海马结构出现明显萎缩，海马CA3 区出现细胞层次减少、细胞损伤、细胞器破坏等［9］。内环境是细胞与外界交流的桥梁。本研究表明慢性应激可导致小鼠海马MDA水平增高，SOD 活力降低，与对照组相比差异有显著性。LNT 干预治疗组与模型组比较，海马组织MDA 水平降低，SOD 活力增高。慢性应激导致小鼠抑郁症的病理生理变化中，氧化与抗氧化的失衡是至关重要的因素之一。LNT 可使小鼠脑组织中的氧自由基得到清除，使得海马组织细胞受自由基攻击损伤的程度减轻，其作用机制可能在于它抑制了氧自由基的释放，同时增强SOD 的活性及SOD 对氧自由基的清除作用，促进了体内氧化与抗氧化系统的平衡，从而保护细胞膜，减轻脑损伤。

神经系统和免疫系统发生的改变在抑郁症的发病机制中起着重要作用，有证据表明，血-脑屏障是可渗透的细胞因子和免疫细胞，并且传入神经，例如迷走神经，调解外周炎性过程和中枢神经系统之间的通信。有研究表明慢性不可预见性刺激所致抑郁小鼠血清中TNF-α 和IL-6 含量明显增多，5-HT 的水平与TNF-α 和IL-6 表达的水平相互拮抗，在慢性不可预见性刺激下，诱导单核巨噬细胞可合成并分泌IL-6 和TNF-α 等细胞因子，IL-6 有可能直接刺激下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴，而HPA 轴功能亢进在抑郁症的发病机制中发挥重要作用［10］。有报道香菇多糖可在免疫应答的主要部分保持不变的情况下，减少急性炎症反应的基因表达，调节免疫减少有害的反应等效果。本文观察到对于应激模型动物，中小剂量的香菇多糖可能表现出免疫调节作用，这一点与国外有关报道一致［11］。

推测LNT 干预后5-HT 含量升高及5-HT1A 受体表达增强有助于体内氧化与抗氧化系统的平衡，进而使单胺递质改变并通过作用于免疫细胞，抑制细胞因子过度表达，调节机体的免疫系统，从而保护细胞膜，减轻脑损伤，最终产生抗抑郁治疗作用。

［1］Knorr U，Vinberg M，Gether U，et al.The effect of escitalopram versus placebo on perceived stress and salivary cortisol in healthy first-degree relatives of patients with depression-A randomised trial［J］.Psychiatry Res，2012，200(2-3):354-360.

［2］Martin JL，Jouldjian S，Mitchell MN，et al.A longitudinal study of poor sleep after inpatient post-acute rehabilitation:the role of depression and pre-illness sleep quality［J］.Amer J Geria Psyc，2012，20(6):477-484.

［3］Liu J，Qiao W，Yang Y，et al.Antidepressant-like effect of the ethanolic extract from Suanzaorenhehuan Formula in mice models of depression［J］.J Ethnopharmacol，2012，141(1):257-264.

［4］Higashi D，Seki K，Ishibashi Y，et al.The effect of lentinan combination therapy for unresectable advanced gastric cancer［J］.Anticancer Res，2012，32(6):2365-2368.

［5］McCormack E，Skavland J，Mujic M，et al.Lentinan:hematopoietic，immunological，and efficacy studies in a syngeneic model of acute myeloid leukemia［J］.Nutrition ＆ Cancer，2010，62(5):574-583.

［6］Parkitny L，McAuley JH，Walton D，et al.Rasch analysis supports the use of the depression，anxiety，and stress scales to measure mood in groups but not in individuals with chronic low back pain［J］.J Clin Epide，2012，65(2):189-198.

［7］Alfonso J，Frasch AC，Flugge G.Chronic stress，depression and antidepressants:effects on gene transcription in the hippocampus［J］.Rev Neurosci，2005，16(1):43-56.

［8］Kraag G，Van Breukelen GJ，Kok G，et al.'Learn Young，Learn Fair'，a stress management program for fifth and sixth graders:longitudinal results from an experimental study［J］.J Chil Psy Psych Alli Disci，2009，50(9):1185-1195.

［9］Rybka J，Kedziora-Kornatowska K，Banas-Lezanska P，et al.Interplay between the pro-oxidant and antioxidant systems and proinflammatory cytokine levels，in relation to iron metabolism and the erythron in depression［J］.Free Rad Biol ＆ Med，2013，63:187-194.

［10］师天元，郭新胜，张红亚，等.首发抑郁症患者治疗前后血浆细胞因子的研究［J］.中国免疫学杂志，2008，24(12):1136-1137.

［11］Bao AM，Meynen G，Swaab DF，et al.The stress system in depression and neurodegeneration:focus on the human hypothalamus［J］.Brain Res Rev，2008，57(2):531-553.